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植物通过平衡生长和对有害刺激的响应来适应环境。在植物的先天免疫反应中，通过识别保守的病原体/微生物相关分子模式（PAMPs/MAMPs）来启动免疫反应。m6A（N6-甲基腺苷）是真核生物转录组中已知最常见的内部共价mRNA修饰，对转录本的命运和功能产生影响。目前针对m6A修饰的研究，主要围绕真核生物的发育和疾病进行，缺乏对植物生物胁迫过程中m6A的动态和调控潜力的了解。
2023年10月30日，宾夕法尼亚大学生物系Brian D. Gregory团队等在《The Plant Cell》期刊发表标题为“Pathogen-induced m6A dynamics affect plant immunity”的研究论文，文章主要通过MeRIP-seq和RNA-seq等分析探讨了植物在生物胁迫下，尤其是病原体感染时，m6A修饰在植物免疫中的作用。
标题：Pathogen-induced m6A dynamics affect plant immunity（病原体诱导的m6A修饰动态调节植物免疫）
时间：2023-10-30
期刊：The Plant Cell
影响因子：IF 11.6
技术平台： MeRIP-seq(m6A)；RNA-seq等
研究摘要：
腺嘌呤（N6-甲基腺苷（m6A））N6 位甲基化介导的 mRNA 转录后调控对植物转录组调控具有深远影响。对真核生物的重点研究得以了解 m6A 在整个发育和疾病状态中的调控过程。然而对植物生物胁迫期间 m6A 的动态和调节潜力缺乏了解。本研究全面分析了 m6A 对拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 病原体信号的短期和长期响应的影响。表明了m6A 缺失的植物对细菌和真菌病原体感染具有更强的抗性，并具有免疫反应变化。此外，m6A 沉积在病原体信号（如鞭毛蛋白）之前和之后与参与防御和免疫的转录物进行特异性协调。因此，m6A 对特定应激反应转录本的动态调节与这些转录本的丰度和剪切变化相关。总的来说，本研究表明 m6A 甲基化在模拟和真实的病原体应激之前和期间受到调控，并在正常生长和病原体反应的协调和平衡中发挥作用。
研究方法：
植物材料和处理：使用拟南芥（Arabidopsis thaliana）的不同基因型植株，包括Col-0、mta ABI3:MTA (mta)、virilizer-2 (vir-2) 和 fip37-4 (SALK_018636) 以及过表达ALKBH10B株系。通过特定的处理方法（如真空渗透法）来模拟和激活植物的病原体响应。
使用RNA测序（RNA-seq）、m6A测序（m6A-seq）和基因组范围的m6A位点分析等技术。
研究结果：
（1）m6A功能调节植物的免疫反应和对病原体感染的免疫力。
Fig1.整体m6A修饰水平对免疫应答的影响
D) flg22诱导的生长抑制：在长期处理flg22后，m6A缺陷型植物（mta和35S:ALKBH10B）的生长抑制更为显著，与Col-0相比，m6A缺陷变株对flg22的响应存在显著差异，表明m6A低甲基化影响植物后期PTI（模式触发免疫）反应。
- 防御相关激素和抗微生物化合物的定量：在Pst DC3000挑战后，mta植物中水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和抗微生物化合物骆驼草素（CA）的水平显著增加，这表明m6A缺陷型植物在优化免疫反应中具有更高的激素和抗微生物化合物水平。
（2）m6A丰度影响病原体暴露前后免疫相关mRNA的表达
Fig2. m6a缺失背景，病原体应激下转录组的变化
ABCD：为了进一步研究在m6a缺失基因型中观察到的免疫表型，利用RNA-seq测了col-0、mta和35S: ALKBH10B植株中flg22以及Pst dc3000处理引发的转录组反应。
E：观察到flg22处理后，缺乏m6A修饰会导致涉及防御防疫的转录本显著富集。这些结果进一步证实了m6A在植物免疫反应中的调控作用，特别是在病原体信号识别前后对转录组的动态调节。
（3）m6A沉积受病原体暴露前后免疫转录本调控
Fig3. m6A甲基化在植物对病原体应激反应中的动态变化。
作者评估了致病侵染前后的m6A甲基化图谱，以进一步解释转录组和整个植株表型。
A）展示了flg22处理前后每个样本的peak数及转录本数
B）m6A在转录本中的分布模式，特别是在3'非翻译区（UTR）和起始密码子后的编码区（CDS）中的富集。
CD）观察到在flg22处理后，幼苗中3 ' UTR的峰值富集减少，开始密码子附近的峰值增加，而在Pst DC3000处理的成年植株中观察到相反的趋势。这可能表明m6A甲基化在病原体信号触发前后的动态变化。
E）作者确定了flg22处理前后mta和35S:ALKBH10B幼苗的低甲基化峰，找到了731个和493个的mta和ALKBH10B靶点。
F）在这些低甲基化转录本中，GO富集显示，在暴露于flg22之前，在免疫和防御相关显著富集，而在处理后，在发育、生长和细胞过程富集，这表明，在对病原体信号的响应中，m6A修饰在与防御和生长权衡相关的转录本中特异性富集。
G）幼苗和成体特异性低甲基化转录本的重叠：在mta中，未处理时幼苗和成体特异性低甲基化转录本的重叠。这些数据进一步证实了m6A在植物免疫反应中的动态调节作用，以及在不同发育阶段对转录组的影响。
（4）flg22处理后，5'mRNA切割位点在m6A peaks中富集，而在含m6A的转录本中含量较低
Fig4. flg22处理过程中含m6A的RNA的转录本稳定性。
（5）m6A区域和条件特异性减少与mRNA丰度差异相关
Fig5. 条件和发育阶段特异性的m6A修饰以及它们对mRNA丰度的影响
A-D) m6A缺失背景下mRNA丰度显著变化的转录本的平均堆叠定位：在14天大的幼苗中，Col-0（黑色）、mta（红色）、增加丰度（虚线）和减少丰度（实线）的转录本在flg22处理前后的分布情况。这些数据显示了m6A标记在转录本中的定位以及在m6A缺失背景下丰度变化的转录本的分布模式。
E) m6A缺失前后转录本FC的累积分布：在mta和35S:ALKBH10B中，m6A缺失前后转录本的累积丰度变化（FC）分布。结果表明m6A在特定条件下可能稳定了这些转录本。
F) 感染前后m6A缺失和mRNA丰度变化的转录本的累积分布：在mta中，与感染前相比，感染后m6A缺失和mRNA丰度显著变化的转录本的累积丰度变化分布。这进一步证实了m6A在病原体感染下对转录本丰度的影响。
研究结论：
研究结果表明，m6A修饰在植物免疫反应中起到了稳定转录本和调节转录组的作用。m6A缺陷植物在模拟和真实的病原体感染前和感染期间表现出增强的抗性。此外，m6A修饰动态变化与转录本的丰度和剪切变化相关联。
研究揭示了m6A甲基化在模拟和真实的病原体胁迫之前和期间的调节作用，并在正常生长和病原体反应的协调和平衡中发挥作用。研究强调了进一步研究m6A标记的协调沉积、移除和解释对于完全理解其在植物生物和非生物胁迫反应中的必要性。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
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参考文献：
Prall W, Sheikh AH, Bazin J, Bigeard J, Almeida-Trapp M, Crespi M, Hirt H, Gregory BD. Pathogen-induced m6A dynamics affect plant immunity. Plant Cell. 2023 Oct 30;35(11):4155-4172. pii: 7248860. doi: 10.1093/plcell/koad224. PubMed PMID: 37610247.
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