易基因：微量DNA甲基化分析揭示MeCP2在卵子发生和卵巢衰老中的表观遗传调控｜项目文章

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DNA甲基化在卵子发生过程中逐渐获得，这一过程由成功的卵泡发育维持，对成功卵泡发育至关重要。异常的早期卵泡发育会导致卵巢老化、早发性卵巢功能衰竭（POF）和女性不孕。然而，作为一种与甲基化DNA特异性结合的表观遗传调控因子，甲基胞嘧啶结合蛋白2（MeCP2）在卵子发生中的功能仍然未知。

2024年4月5日，浙江大学医学院附属邵逸夫医院副研究员张银丽博士和张松英教授共同通讯在《Cellular and Molecular Life Sciences》杂志发表题为“CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes”的科学研究论文。本研究通过微量甲基化测序和对应的转录组测序分析等揭示了MeCP2在卵巢中的功能和蛋白质降解机制，表明CRL4DCAF13 E3连接酶靶向MeCP2降解，从而防止DNA高甲基化并保持正常转录的新机制，并预示DCAF13-MeCP2轴异常参与卵巢衰老。深圳市易基因科技为本研究提供微量全基因组重亚硫酸盐测序分析技术服务。

标题：CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes（CRL4DCAF13 E3泛素连接酶靶向MeCP2降解，以防止DNA高甲基化，并确保生长中的卵母细胞中正常转录。）

时间：2024.04.05

期刊：Cellular and Molecular Life Sciences

影响因子：IF 8 / 1区

实验方法：Western Blot、转录组分析、微量WGBS等

研究摘要：

本研究通过对野生型ICR小鼠和转基因小鼠的一系列比较分析结果表明，MeCP2蛋白在原始卵泡和初级卵泡中高表达，但在次级卵泡中几乎检测不到。但在衰老卵巢中，卵母细胞和颗粒细胞中的MeCP2蛋白显著增加。生长中的卵母细胞中的MeCP2过表达会导致转录失调、DNA高甲基化和基因组不稳定，最终导致卵泡生长停滞和凋亡。DCAF13是Cullin 4-RING（CRL4）E3连接酶的底物识别接头，可以靶向MeCP2，并在细胞和卵母细胞中被多泛素化以进行降解。Dcaf13基因敲除的卵母细胞表现出MeCP2蛋白积累，并且在MeCP2敲低后部分挽救了由Dcaf13缺失诱导的卵泡生长停滞。RNA-seq结果揭示生长中的卵母细胞中，大量基因受DCAF13-MeCP2轴调控。本研究表明，CRL4DCAF13 E3泛素连接酶靶向MeCP2进行降解，以确保生长中的卵母细胞中正常的DNA甲基化和转录。此外，在衰老的卵泡中，观察到DCAF13和DDB1蛋白的死亡，表明了一种潜在调控卵巢衰老的新机制。

DCAF13-MeCP2轴参与卵泡生长示意图

在次级卵泡中，MeCP2在年轻卵母细胞中被CRL4DCAF13 E3连接酶多泛素化并降解。这一过程促进了与翻译和ATP合成相关的基因表达，同时抑制了与染色质修饰相关的基因表达。因此确保了从次级卵泡到窦卵泡的成功发育。在衰老的卵母细胞中，DDB1和DCAF13水平的降低稳定了MeCP2，导致CpG岛中的DNA高甲基化、转录失调和卵泡生长停滞。

实验方法：

通过CRISPR/Cas9技术敲除特定基因，对野生型ICR小鼠和转基因小鼠进行了一系列实验操作和分析。以研究其对卵子生长和卵泡发育的影响。

使用多种实验技术，包括免疫荧光分析、Western Blot、qRT-PCR、RNA-seq、微量全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）等。

研究结果：

（1）MeCP2蛋白在原始卵泡和初级卵泡中高表达，并在衰老的卵巢中积累

图1：MeCP2蛋白在原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞中高表达，并且随着年龄的增长而表达量增加。

1. 抗MeCP2抗体（ab2828）染色的Ddx4-Rfp小鼠不同阶段卵泡的代表性图像。Pm表示原始卵泡，Pr表示初级卵泡，Sec表示次级卵泡，Ant表示窦卵泡。
2. (A)中所指阶段卵泡中卵母细胞MeCP2荧光强度的定量。
3. 5日龄和21日龄产后小鼠卵巢中MeCP2表达的Western Blot分析。
4. 使用抗MeCP2抗体，对2月龄和11月龄的野生型小鼠的卵泡进行Western Blot分析。
5. 使用抗MeCP2抗体对2月龄和11月龄的Ddx4-Rfp小鼠卵巢进行免疫荧光染色。
6. (E)中卵母细胞MeCP2荧光强度的定量。

（2）MeCP2 过表达损害卵泡生长和存活

图2：MeCP2在生长中的卵母细胞中过表达抑制卵泡生长。

1. 实验设计。Flag或Flag-MeCP2 cRNAs显微注射到次级卵泡的卵母细胞中，结合或不结合mCherry cRNAs，然后培养1-6天。在第1、3和6天进行卵泡直径测量和死亡率统计。同时，在第1和第3天收集免疫荧光样本。第6天收集卵泡培养基进行激素测定。
2. 免疫染色显示MeCP2过表达对次级卵泡生长中的卵母细胞DNA结构（DAPI）的影响。
3. (B)中红虚线指示的DAPI染色信号定量。
4. 在Flag或Flag-Mecp2 cRNAs过表达后第1、3和6天卵泡发育的代表性的明场显微照片。
5. 对照组（n=32）或MeCP2过表达组（n=33）中，第1、3和6天的卵泡直径定量。
6. 对照组或MeCP2度表达组（n=72-76）中，第1、3和6天的卵泡死亡率定量。

G,H. Ki67（G）和PCNA（H）在对照组和MeCP2过表达卵母细胞中的免疫荧光结果。

1. Western blotting结果显示对照组和MeCP2过表达卵母细胞中的Ki67、Cleaved-PARP和FLAG表达。

J. MeCP2过表达卵泡卵母细胞中的γH2AX免疫荧光结果。

K. 在Flag或Flag-Mecp2（白色箭头）cRNAs过表达后，同一图像中生长中的卵母细胞的TUNEL免疫荧光结果。

L. 第6天卵泡培养基中雌二醇测量。

（3）MeCP2过表达诱导生长期卵母细胞转录失调

图3：MeCP2过表达诱导生长中的卵母细胞转录失调。

1. Ddx4-Rfp小鼠不同阶段卵泡卵母细胞中pPSII的免疫荧光染色。白色箭头指示原始卵泡。pPSII，C末端域Ser 5位点的磷酸化RNA聚合酶II。
2. (A)中卵母细胞pPSII荧光强度定量。
3. 出生后第1天、5天和10天小鼠卵巢中pPSII的Western Blot分析。
4. 在Flag或Flag-Mecp2 mRNAs过表达1天后，用抗pPSII和5-乙炔基尿嘧啶（EU）对卵母细胞进行免疫染色，以指示卵母细胞中的RNA转录活性。
5. (D)中pPSII和EU荧光信号强度定量。
6. Flag或Flag-Mecp2 mRNAs过表达后生长中的卵母细胞中pPSII蛋白水平的Western Blot结果
7. 散点图显示对照组（Ctrl）和MeCP2过表达（MeCP2 OE）卵母细胞之间的转录变化。基因表达增加或减少超过两倍分别用红色和蓝色表示。

H,I. MeCP2过表达卵母细胞中上调（H）和下调（I）的GO分析生物学过程富集。

J. MeCP2过表达卵母细胞中指示信号通路的GSEA富集图和关键组分基因的箱线图。

（4）MeCP2过表达诱导生长期卵母细胞DNA高甲基化

图4：MeCP2在生长中的卵母细胞中过表达导致CpG岛的DNA高甲基化。

1. 通过微量全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）对对照组和MeCP2过表达组卵母细胞样本的主成分分析（PCA）（三个生物学重复）。
2. 对照组和MeCP2过表达组卵母细胞样本中mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
3. 密度图显示MeCP2过表达生长中的卵母细胞二价CpG岛周围的平均DNA甲基化增加。
4. 对照组和MeCP2过表达组生长中的卵母细胞内基因体和2kb侧翼（上游和下游）区域内mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
5. 对照组和MeCP2过表达组生长中的卵母细胞内转座元件（TE）和2kb侧翼区域内mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
6. MeCP2过表达后上调和下调基因的基因体和启动子区域内mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
7. 维恩图显示差异表达基因（DEGs）与差异甲基化区域相关基因（DMGs）的交集。
8. （G）中交集基因的GO注释的生物学过程。
9. 基因组浏览器综合视图显示MeCP2过表达后甲基化水平增加和mRNA下调的Cldn34d基因。

（5）CRL4DCAF13靶向MeCP2在HeLa细胞中的泛素化和降解

图5：MeCP2被多泛素化并通过CRL4DCAF13 E3连接酶降解。

1. 在10-μM MG132或MLN4924处理6小时和12小时后，Hela细胞MeCP2蛋白水平的Western Blot分析。
2. 经FLAG-GFP、FLAG-DCAF13、FLAG-DDB1和FLAG-CUL4A转染的Hela细胞MeCP2内部和FLAG的免疫荧光结果。
3. 靶向阴性对照（siNC）、Dcaf13（siDcaf13）和Ddb1（siDdb1）的siRNAs转染后Hela细胞指定蛋白的Western Blot分析。
4. 经对照、FLAG-DCAF13和FLAG-DDB1质粒转染的Hela细胞，分别在0、6、12和24小时CHX处理的MeCP2、DDB1和DCAF13表达的Western Blot分析结果。
5. MeCP2与DCAF13、DDB1和CUL4A在Hela细胞中互作的免疫沉淀和Western Blot结果。
6. 免疫沉淀后进行Western Blot分析，显示对照Hela细胞以及指定蛋白编码质粒转染细胞中MeCP2多泛素化。

（6）卵母细胞Dcaf13缺失导致MeCP2蛋白积累并抑制卵泡生长

图6：Dcaf13基因敲除导致生长中的卵母细胞中MeCP2的积累和转录失调。

1. 21日龄的野生型（Dcaf13f/f）和Dcaf13条件性敲除（cKO, Dcaf13f/f; Gdf9-Cre）小鼠卵巢的DCAF13免疫组化代表性图像。
2. 21日龄的野生型（Dcaf13f/f）和Dcaf13 cKO（Dcaf13f/f; Gdf9-Cre）小鼠卵巢的H&E染色代表性图像。
3. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠卵母细胞中MeCP2、pPSII和DCAF13蛋白水平的Western Blot结果。
4. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的次级卵泡中MeCP2表达的免疫荧光。
5. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的卵泡卵母细胞核中pPSII表达的免疫荧光结果。
6. (E)中pPSII荧光信号强度定量。
7. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的次级卵泡中，分别在siNC或siMecp2微注射后第1、3和6天的卵泡发育的明场图像（每组n=2只小鼠）。
8. (G)中指定组的卵泡直径定量。
9. 2月龄和11月龄小鼠卵母细胞中pPSII、DDB1和DCAF13表达的Western Blot结果。

（7）与染色质共价修饰相关的DCAF13-MeCP2轴异常抑制翻译和激活基因表达

图7：DCAF13-MeCP2轴异常导致生长中的卵母细胞基因表达异常。

1. 野生型（WT, Dcaf13f/f）和Dcaf13条件性敲除（cKO, Dcaf13f/f; Gdf9-Cre）卵母细胞之间的转录变化散点图。基因表达增加或减少超过两倍分别用红色和蓝色表示。
2. 上方的维恩图显示Dcaf13 cKO上调基因与MeCP2过表达上调基因的重叠，而下方维恩图显示Dcaf13 cKO下调基因与MeCP2过表达下调基因的重叠。
3. 热图显示Dcaf13 cKO或MeCP2过表达相对于各自对照后生长中的卵母细胞中下调和上调基因。
4. 通过基因本体（GO）分析获得的MeCP2过表达卵母细胞中下调和上调的生物学过程富集，在Dcaf13 cKO卵母细胞中重叠。

E,F. 热图显示MeCP2过表达卵母细胞中上调（E）和下调（F）基因的表达动态，这些基因在Dcaf13 cKO卵母细胞中重叠。

易基因小结：

本研究主要揭示了CRL4DCAF13 E3连接酶复合体通过靶向MeCP2的降解，在维持卵子生长和卵泡发育中发挥重要作用。

MeCP2的异常积累会导致DNA甲基化失衡和转录失调，影响卵泡的正常生长。

研究为理解卵巢衰老的分子机制提供了新视角，并可能为治疗与卵巢衰老相关的疾病提供潜在的靶点。

目前，易基因科技有限公司在DNA甲基化修饰等表观遗传检测领域，积累了一系列国际先进技术，可对高通量单细胞甲基化组学研究，微量DNA甲基化测序，ctDNA、FFPE等严重降解痕量DNA甲基化检测等，提供多种有效解决方案。低成本、高通量的单细胞甲基化组学测序技术建立，将为研究者对不同时间和空间的单细胞表观修饰研究奠定基础。

1. 微量细胞或单细胞全基因组甲基化测序(Micro DNA-WGBS)DNA起始量：
   单细胞/100-1000个细胞
   1ng基因组DNA
   90%以上基因组CG覆盖
2. 微量细胞或DNA简化基因组甲基化测序(Micro DNA-RRBS)DNA起始量：
   1ng基因组DNA；
   10-20M有效CG位点覆盖；
   10-20G测序数据量；
3. 微量cfDNA简化基因组甲基化测序(cfDNA-RBS)

• 100ul血浆或1ng cfDNA
• 10M有效CG位点覆盖
• 15-20G测序数据量

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参考文献：

Ren P, Tong X, Li J, Jiang H, Liu S, Li X, Lai M, Yang W, Rong Y, Zhang Y, Jin J, Ma Y, Pan W, Fan HY, Zhang S, Zhang YL. CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes. Cell Mol Life Sci. 2024 Apr 5;81(1):165. pii: 10.1007/s00018-024-05185-4. doi: 10.1007/s00018-024-05185-4. PubMed PMID: 38578457.

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