染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(3)：实验分组&对照

第三部分：实验分组设计及对照

样本间分组（实验组Treated、对照组Control）

在实验设计时，实验组Treated和对照组Control最低限度要各设置一组，每组的最低数量是3个生物学重复。再根据实验组不同的药物浓度或是不同的处理时间可以设置不同梯度的多个实验组Treated。

样本内对照（Input管、IgG管、Anti-target管）

在做ChIP-qPCR实验中，同一个样本需要分成3份（Input管，IgG管，Anti-target antibody管），准确说是4份，因为每个样本都需要额外取一点用于DNA片段化情况的质控。Input管是按照一定比例分出的原始样本（在ChIP中是指断裂后的原始基因组DNA片段混合物，未进行抗体结合），一般采用1%的比例，在下游荧光定量PCR数据分析时需要把这个1%的比例换算为100%整体样本，以便作为目的DNA片段全部的量用于计算沉淀富集的目的DNA片段的占比。

提示：在ChIP-seq实验中可以不设置IgG管，因为阴性对照没必要拿去测序。

注意：

IgG管，Anti-target管统称为IP管，都需要进行免疫沉淀富集目的DNA片段的完整流程（IgG管使用normal IgG结合，Anti-target管使用目的蛋白的一抗结合，后续均使用Protein A/G磁珠捕获，并洗脱目的DNA）。

Input管不需要进行免疫沉淀流程，直接进入下游PCR实验或是二代测序sequence。

样本输入对照Input和抗体阴性对照IgG是最基本的实验对照。均为必做对照，因为没有对照，很难对实验结果的可靠性进行评估，也无法对下游的荧光定量PCR数据进行统计分析。

一、必做对照如下

1、输入对照Input：必须设置。

2、阴性对照IgG：ChIP-标准PCR或是ChIP-荧光定量PCR必须设置此对照，而在ChIP-sequence实验中一般无需设置。

Non-specific IgG 是从没有经过任何抗原免疫的动物得到的不识别任何靶标抗原的免疫球蛋白IgG，因此可以作为目的抗体的阴性对照。

注意：Non-specific IgG来源物种要和目的蛋白的抗体来源于同一种属。

上图为样本内分组的微观分子示意图

二、选做对照如下

1、阳性抗体对照：选做

一般第一次做ChIP实验时需要做一个阳性抗体对照，用于验证整体实验样本和实验体系的有效性，阳性抗体通常选择与比较保守的已知靶标蛋白相结合的抗体，例如组蛋白H3抗体或RNA Polymerase II抗体等。但阳性抗体对照的实验结果只是用于评估实验体系是否成功，不参与后续的荧光定量PCR数据分析。而且后续实验体系顺畅时就不需要做阳性抗体对照了。

2、PCR的阴性引物对照：选做

考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能，所以通常还会选择数对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。

3、PCR的阳性引物对照：选做

4、Spike-in参照：选做

什么是ChIP spike-in？

ChIP Spike-in指的是在一个ChIP实验中，在纯化富集得到的目的DNA片段混合液中掺入一定量的已知序列外源DNA片段（最常用的就是lambda噬菌体的DNA）用于整个实验的质控及标准化，后续的荧光定量PCR可以检测Spike-in，得到的Ct值可以作为内参对目的Ct值进行标准化处理。也可以用在下游的二代测序中。

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