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RSS订阅原创 染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(7)：下游PCR、qPCR及sequence
染色质免疫沉淀(ChIP)技术下游衔接三大实验：PCR、qPCR及sequence
2024-08-28 10:24:43
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原创 染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(6)：操作步骤Protocol
上述用于质控DNA片段长度的样本在蛋白酶K消化后得到游离DNA片段，可以直接用于琼脂糖凝胶电泳，也可以使用 DNA纯化试剂进一步的纯化后再电泳，在DNA纯化过程中高丰度的RNA会干扰目的DNA纯化，因此需要使用 RNase A 处理样本，否则纯化步骤会被RNA干扰而导致DNA产物大大减少。不是简单的混合在一起的，而是一个融合表达分子，将两种分子的优势集于一身，可以对实验中绝大部分种属来源的抗体都有很高的亲和力，能强力捕获常见的兔源抗体、小鼠源抗体、山羊源抗体、绵羊源抗体、人源抗体及大鼠源抗体等。
2024-08-27 16:56:21
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原创 染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(5)：所用ChIP kit 及仪器
• 全长接头试剂盒Multiplex Oligos for Illumina® (Full Length Adaptors) (for ChIP-seq, CUT&RUN)，品牌：Engibody，货号为LIB-SEQ-30001，用于ChIP-seq中对免疫富集得到的DNA片段进行测序文库构建时需要。• Smart-Lib™ DNA建库试剂盒 for illumina® （超声及MNase法），品牌：Engibody，货号为LIB-SEQ-30000-12。
2024-08-27 16:44:12
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原创 染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(4)：实验结果&示例展示
ChIP实验仅仅是从样本中免疫沉淀富集特定目的DNA片段的过程，必须衔接下游实验才能得出有价值的结果。最常见的下游实验有四种。此方法已经基本被功能强大的二代测序所淘汰了。全部位点的组蛋白修饰水平或转录因子结合水平。特定位点的组蛋白修饰水平或转录因子结合水平。特定位点的组蛋白修饰水平或转录因子结合水平。第四部分：实验结果与示例展示。全基因组范围内的筛选和发现。
2024-08-27 16:40:06
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原创 染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(3)：实验分组&对照
一般第一次做ChIP实验时需要做一个阳性抗体对照，用于验证整体实验样本和实验体系的有效性，阳性抗体通常选择与比较保守的已知靶标蛋白相结合的抗体，例如组蛋白H3抗体或RNA Polymerase II抗体等。ChIP Spike-in指的是在一个ChIP实验中，在纯化富集得到的目的DNA片段混合液中掺入一定量的已知序列外源DNA片段（最常用的就是lambda噬菌体的DNA）用于整个实验的质控及标准化，后续的荧光定量PCR可以检测Spike-in，得到的Ct值可以作为内参对目的Ct值进行标准化处理。
2024-08-27 16:36:24
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原创 染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(2)：技术流程
根据实验者研究的目的蛋白不同，采用2种不同的技术路线•如果研究的是转录因子，转录因子和启动子DNA元件的结合一般都是弱结合，是容易解离的，且转录因子在细胞内的丰度较低，所以一般采用甲醛固定交联转录因子和DNA，超声打断得到染色质小片段的技术流程。•如果研究的是组蛋白甲基化或乙酰化修饰，细胞内丰度较高，且DNA缠绕在组蛋白上，是相对强结合，不易解离，因此一般无需甲醛固定交联，MNase (Micrococcal Nuclease) 酶切即可得到染色质小片段。
2024-08-27 16:29:49
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原创 染色质免疫沉淀ChIP技术笔记之(1)：应用场景
染色质免疫沉淀ChIP实验技术是理解染色体的一种革命性工具，使研究者可以了解DNA及其相结合的调控因子之间的时空动态相互作用。
2024-08-27 16:18:27
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