染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(7)：下游PCR、qPCR及sequence

下游衔接的三大实验

一、标准PCR

用于定性（有或无）检测、验证特定位点的组蛋白修饰水平或转录因子结合水平。

暖心建议

•使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。

•请使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。（请自备，本试剂盒中不包含标准PCR的酶）

•如有必要，实验者可以合成Human的GAPDH基因的PCR引物对作为目的蛋白抗体免疫沉淀后PCR的阳性对照引物对，这一步可选做。

引物序列如下：

5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'                                            

5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'

但有一点需要注意，有些靶蛋白的ChIP实验是不适合采用GAPDH的基因来作为靶蛋白抗体的阳性引物对照的，因为异染色质区域的组蛋白修饰类型（例如H3K9me3或H3K27me3等修饰）不会发生在GAPDH基因上，GAPDH是管家基因，一直高表达，一般不会发生H3K9me3或H3K27me3等抑制基因表达的修饰类型。

这时，如果一定要做阳性对照，还可以采用另一个方案，使用阳性抗体histone H3抗体配合靶基因的特异性引物来做PCR，因为任何靶基因都有组蛋白的结合，所以histone H3抗体免疫沉淀下来的DNA用靶基因引物做PCR也肯定会产生阳性信号。

使用者针对目的DNA 设计适宜的特异性引物至关重要。

应当遵循以下标准设计引物：

引物长度：	24 个核苷酸左右
最佳 Tm：	60℃
最佳 GC含量：	50%
扩增片段长度：	150 至 200 bp（标准 PCR）

常规PCR实验Protocol

根据待分析样品的数量，标记适宜数量的 0.2 mL PCR管。这些样品应当包括1%样品Input输入对照、阴性对照 Normal Mouse/Rabbit IgG样品，和未加入任何DNA模板的空白对照以排除PCR反应中的DNA污染。

向每管中添加2 μL相应的DNA样品。

按下文所述的配比配制PCR反应液总管，记住计算时多算两份以弥补分管时的体积损耗。配好后，向每个PCR管中加入18 μL反应液混合物。

试剂	每个 PCR 反应(20 μL)所需体积
无核酸酶的 H2O	12.5 μL
10× PCR 缓冲液（含氯化镁）	2.0 μL
4mM dNTP 混合物	1.0 μL
Taq DNA 聚合酶	0.5 μL
5 μM引物	2.0 μL

设定并执行以下PCR反应程序：

a.	预变性	95℃	5分钟
b.	变性	95℃	30秒
c.	退火	60℃	30秒
d.	延伸	72℃	30秒
e.	重复步骤 b-d，共循环 34 次
f.	终末延伸	72℃	5分钟

从每个PCR反应管中取出10 μL PCR产物，使其与100 bp DNA marker同时进行2%琼脂糖凝胶电泳，以进行分析。

二、荧光定量PCR

用于定量（多或少）检测、验证特定位点的组蛋白修饰水平或转录因子结合水平。

暖心建议

•使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。

•如有必要，实验者可以合成Human的GAPDH基因的PCR引物对作为目的蛋白抗体免疫沉淀后PCR的阳性对照引物对，这一步可选做。

引物序列如下：

5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'                                            

5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'

但有一点需要注意，有些靶蛋白的ChIP实验是不适合采用GAPDH的基因来作为靶蛋白抗体的阳性引物对照的，因为异染色质区域的组蛋白修饰类型（例如H3K9me3或H3K27me3等修饰）不会发生在GAPDH基因上，GAPDH是管家基因，一直高表达，一般不会发生H3K9me3或H3K27me3等抑制基因表达的修饰类型。

这时，如果一定要做阳性对照，还可以采用另一个方案，使用阳性抗体histone H3抗体配合靶基因的特异性引物来做PCR，因为任何靶基因都有组蛋白的结合，所以histone H3抗体免疫沉淀下来的DNA用靶基因引物做PCR也肯定会产生阳性信号。

特别提醒：

ChIP-qPCR和普通逆转录-qPCR的引物设计有很大不同。

普通逆转录 qPCR引物设计里一个很重要的原则是引物序列要跨内含子，目的就是把cDNA模板和genomic DNA模板区分开来，避免引物结合到残留的genomic DNA模板上，导致假阳性非特异性扩增信号。

而在ChIP-qPCR的引物设计中，则不需要这样，如果这样做，对有些组蛋白修饰的位点反而检测不出来了。因为ChIP-qPCR使用的模板就是来自genomic DNA，是很多“碎小”的原始基因组DNA，最常见是基因的启动子区域或者转录起始位点TSS上下游的2kb左右的区域（可能会包含外显子区域），所以这时候使用在线qPCR引物设计软件或是仪器自带引物设计软件的时候，一定要清晰的明确这一点，要把这个模板区域的序列信息“告知”仪器或是软件，这样设计出来的引物才能符合ChIP-qPCR。

设计引物除了上述这点，还需要遵循以下标准：

A、引物长度： 17～25 mers

B、GC 含量： 40～60%（45～55%理想）

C、Tm 值：Forward Primer 和 Reverse Primer 的 Tm 值不能相差太大。

D、引物序列：A、G、C、T 整体分布尽量均匀。 不要有部分的 GC rich 或 AT rich（特别是 3’端）。 避开 T/C（Polypyrimidine）或 A/G（Polypurine）的连续结构。

E、3’末端序列：避免 GC rich 或 AT rich。3’端碱基最好为 G 或 C。尽量避免 3’末端碱基为 T。

F、互补序列：避开引物内部或两条引物之间有 3 个碱基以上的互补序列。

G、PCR 扩增产物长度： 80～150 bp 较为合适（可以延长至 300 bp）。

荧光定量PCR实验Protocol

标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 板。PCR 反应应当包括靶蛋白抗体Anti-target IP样品、阴性对照 Normal Mouse/Rabbit IgG样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的空白对照和 1% 输入对照Input组染色质 DNA 的连续稀释物（未稀释、1:5、1:25、1:125），以生成标准曲线并测定扩增效率（扩增效率的测定是可选做的）。

向 PCR 平板上的每管或每孔中添加2 μL相应的DNA模板样品。

按下文所述的配比配制PCR反应液总管，记住计算时多算两份以弥补分管时的体积损耗。配好后，向每个PCR管中加入18 μL反应液混合物。

以 LightCycler/LightCycler480 System的操作方法为例:

试剂	每个 PCR 反应(20 μL)所需体积
无核酸酶的 H2O	6 μL
qPCR Master Mix (SYBR Green) （Kit里自带）	10 μL
5 μM引物对	2 μL

试剂盒中自带的qPCR Master Mix套装说明如下：

2x qPCR Master Mix (SYBR Green) (with RNase H)： 1.25mL *2        

ROX Reference Dye I（50×）： 100μL

ROX Reference Dye II（50×）：100μL

ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。例如使用 Applied Biosystems 的 Real Time PCR 扩增仪进行实验就需要校正。

•需要使用 ROX Reference Dye I校正的仪器

Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)

•需要使用 ROX Reference Dye II 校正的仪器

Applied Biosystems 7500 和 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)

•不需要校正的仪器

Thermal Cycler Dice™ Real Time System III (Code No. TP950/TP970/TP980/TP990) Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Code No. TP700/TP760) Smart Cycler II System(Cepheid) LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)

设定并执行以下PCR反应程序：

a.	预变性	95℃	30秒
b.	变性	95℃	10秒
c.	退火及延伸	60℃	30秒
d.	重复步骤 b-c，共循环40次

后续的反应条件如下：

熔链反应

分析模式：熔链曲线

95℃ 5 秒 (Ramp rate：4.4℃/秒)

60℃ 1 分钟 (Ramp rate：2.2℃/秒)

95℃ (Ramp rate：0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃)

1 cycle

降温步骤

50℃ 30 秒 (Ramp rate：2.2℃/秒)，1 cycle

注意：

本产品是利用anti-Taq抗体的Hot Start 作用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用 DNA 聚合酶相比，不需要PCR反应前的 95℃、5～15分钟的酶的活化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

荧光定量PCR结束后，使用实时荧光定量PCR仪的自带软件，分析定量PCR的结果。查看qPCR三大曲线：扩增曲线、熔链曲线、标准曲线（制作标准曲线计算此次扩增效率）

荧光定量PCR数据分析

两种常用的标准化 ChIP-qPCR 数据分析方法——Percent Input法和富集倍数法（Fold Enrichment）。建议ChIP 实验设置样本的生物学重复，尽可能将结果信号和标准差一起显示。

Input百分比法（Percent Input法）

建议采用此方法进行荧光定量PCR数据分析

简言之，这种方法的思想就是：把每次免疫沉淀获得的靶信号表述为占总Input样品染色质（总Input样品染色质的意思就是这次实验每个样本超声或酶切后得到的总染色质）的百分比。

具体计算方法如下：

从ChIP获得的anti-target组和IgG组信号除以总Input样品染色质。通常1%的起始染色质用作Input，即实验中Input管取的是原始样本染色质总量的1%，需要换算成100%的Input，则从1%的Input的Ct值中减去6.644 cycles（100的log2）。

下表中的数据作为示例，仅供参考，不同实验做出的Ct值是不同的

     

最终分析结果如下图所示：

富集倍数法（Fold Enrichment法）

该方法将ChIP 信号除以阴性对照抗体信号，将ChIP信号表示为信号相对于背景信号的倍数增加。该方法建立在背景信号的水平在不同的引物组、样品和重复实验间可重复的假设上。

注意：本实验Protocol建议使用更常见的Input百分比法进行荧光定量PCR数据分析，用一种方法即可。

三、二代测序NGS

用于在全基因组范围内Genome wide筛选和发现全部位点的组蛋白修饰水平或转录因子结合水平。

基本流程如下：

1、DNA文库构建及质控

2、Illumina® 平台上机测序

3、生物信息学数据分析（peak鉴定，GO数据库分析及KEGG数据库分析等）

4、生物信息学图表绘制（Peak峰图，火山图等）

ChIP-seq实验原理一览图

操作步骤如下：

一、DNA文库构建

1、DNA片段粘性末端补平修复

2、5'端加磷酸基团及3'端加A

3、加测序用接头Adaptors

4、建库PCR扩增

5、DNA文库PCR产物纯化

用本试剂盒制备的免疫富集的DNA片段样本可用于ChIP-seq。要构建下游NGS测序用的DNA文库，请使用与您的下游测序平台相容的DNA文库制备实验步骤或试剂盒。

对于Illumina® 平台上测序，我们建议使用Engibody品牌的DNA建库试剂盒Smart-Lib™ DNA library Prep Kit for illumina®，该试剂盒专为酶切法和超声法得到的DNA片段构建测序文库而设计，货号为LIB-SEQ-30000-12。

随后需要使用和该建库试剂盒配套的测序引物试剂盒和测序接头试剂盒，Engibody品牌的这两个盒子，任选其一即可。一个是全长接头试剂盒Multiplex Oligos for Illumina® (Full Length Adaptors) (for ChIP-seq, CUT&RUN) ，货号为LIB-SEQ-30001。另一个是长引物试剂盒Multiplex Oligos for Illumina®  (Unique Dual Indexed Primers) (for ChIP-seq, CUT&RUN)，货号为LIB-SEQ-30002。

二、DNA文库质控

在构建好测序DNA文库之后，在上机测序之前需要对构建好的DNA文库的片段大小、纯度及浓度进行评估和质控。同时也可以检测DNA文库中是否存在接头二聚体（约140 bp）。如果DNA文库中存在接头二聚体，则需要再次纯化PCR扩增产物去除接头二聚体以免影响后续上机测序。

DNA文库的浓度和纯度可以使用Nanodrop分光光度计进行测定，DNA片段长度大小的分布情况则需要使用下述方法进行测定：

有3种质控方法，任选一种即可

Option 1: 使用2%琼脂糖电泳查看DNA片段大小的分布情况（推荐）。

Option 2: 使用安捷伦的Bioanalyzer 2100生物分析仪

（配套试剂品名： Agilent High Sensitivity DNA Kit，品牌：Agilent，货号：G2938-90322）

Option 3: 使用Qsep 100毛细管电泳仪来做文库质控。

三、提供构建好的DNA文库，请商业化二代测序公司对文库进行测序，生信分析和作图。

ChIP-seq生物信息学分析流程一览图

Illumina二代测序平台的ChIP-seq流程

适用于传统超声法断裂和MNase酶切法切断的DNA文库

Illumina二代测序平台的两种接头adaptors类型

适用于传统超声法断裂和MNase酶切法切断的DNA文库构建

Illumina的边合成边测序的微观示意图

ChIP-seq测序中最为关键的Peak峰是如何生成的？

ChIP-seq peaks are characterized by a local enrichment of ChIP-seq reads compared to control, and are observed over the binding sites for the TF under investigation.

ChIP-seq reads are sequenced from fragments bound to the TF. B. Reads are ligated to 5′ adapters. C. Reads are sequenced from the 5′ end due to how the adapters are attached. D. This results in a bimodal distribution of reads around the location of the TF binding site.

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