染色质免疫沉淀(ChIP)技术笔记之(8)：疑难解答

第八部分：ChIP常见问题与解决方案

问题	可能的原因	建议的解决方案
1. 片段化的染色质浓度过低。	用于染色质片段化的细胞数不足，或者胞核在细胞裂解后未完全裂解。	在交联之前计算备用培养皿中细胞的数量，以确定准确的细胞数量，或在超声波/酶切处理前后在显微镜下观察胞核，以确认胞核是否完全裂解。
2. 染色质处理后的片段过大（大于 1000 bp）。	细胞可能已经过度交联。交联超过 10 分钟可能会抑制染色质的片段化。 在染色质片段化过程中添加了过多的细胞或未添加足够的 MNase,或者超声不足。	将甲醛交联时间缩短至少于 10 分钟或更短。 在交联之前计算备用培养皿中细胞的数量，以确定准确的细胞数量。
3. 染色质过度打碎并且片段过小（只有 150 bp 单核小体的长度），在 PCR 定量期间，将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能削弱信号，尤其对于长度大于 150 bp 的扩增子更是如此。	添加至染色质片段化的细胞不足或 MNase过多，或者超声过度。	在交联之前计算备用培养皿中细胞的数量，以确定准确的细胞数量；降低超声强度，或者减少酶的用量和酶切时间。
4. Input样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。	添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。 PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。 染色质过度片段化。	向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 使用来自交联并消化后的染色质的纯化DNA，优化实验引物序列和PCR条件。设计不同的引物对并将扩增子的长度减少到小于 150 碱基对。
5. 阳性对照组蛋白 Histone H3抗体IP后目的基因引物的PCR反应中无产物。	添加至 IP 反应的染色质或抗体不足，或者 IP 孵育时间过短。 Protein A/G磁珠捕获的DNA片段洗脱不完全。	确保向每次 IP 反应中添加 5-10 μg 染色质和 10 μL 抗体并和抗体一起孵育过夜。在添加Protein A/G磁珠后需额外孵育 2个小时。 在洗脱时可增加在65℃高温孵育3-5小时的步骤，加强解交联。需要频繁混合以保持磁珠悬浮在溶液中。
6. 阴性对照Mouse/Rabbit IgG的 PCR 反应中产物数量也相当多。	添加至 IP 反应的染色质过多。或者，添加至 IP 反应的IgG用量过多。 添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。	向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质。每次 IP 将 Normal Mouse/Rabbit IgG缩减至1 µL/IP管。 向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则，不能准确测量起始 DNA 数量的差异。
7. 实验目的抗体IP后PCR反应中无产物。	添加至PCR反应的DNA不足。 添加至IP反应的抗体量不足或不适用。	向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 通常，需向IP反应中添加1至 5 µg的抗体；但是，实际加入量很大程度上取决于各个抗体本身。 增加添加至IP反应的抗体量。或者尝试其他替代抗体。

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