非因解读 | 肿瘤免疫治疗纪元下的多重IHC/IF技术总览

肿瘤免疫治疗纪元下的

多重IHC/IF技术总览

免疫组化（IHC）是组织病理学中广泛使用的诊断和检测技术，但这项技术却存在一些无法逾越的瓶颈，如主观因素造成的不同判别差异，半定量劣势，可检测靶标数限制等。随着医学诊断技术的不断发展，多重靶标技术（以IHC/IF技术为代表）以多重染色、精确的光谱拆分和定量为优势点，可以在有限样本上获得更为丰富的空间表达谱数据，高效且可重复，在转化医学和临床治疗领域，尤其是肿瘤免疫治疗方向上获得了广泛的关注和应用。

2020年3月Wei Chang ColinTan等人在《CANCER COMMUNICATIONS》上发表题为“Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy”的文章（图1）。文章根据多重IHC/IF的原理，将其分为基于显色染料技术、基于金属同位素技术、基于荧光技术和基于DNA barcode技术等四大技术平台，并将四大技术平台进行了汇总与比较。

图1

其中基于DNA barcode的DSP（Digital Spatial Profiler）空间多组学技术平台，是针对肿瘤免疫和肿瘤微环境设计的高精度、多维度分析的新一代空间组学技术。通过在单张切片上选择合适的兴趣点（Region of Interest，ROI），来实现基于每个ROI微环境的100重蛋白或＞18,000重全转录组的原位表达谱分析。该技术在2019年AACR一经推出就受到全球肿瘤学家和肿瘤免疫学家的热捧，非因生物凭借在癌症蛋白组学与系统生物学研究中的独特优势，引入国内首家DSP空间多组学技术平台，并已成功服务近百个客户，与中国医学科学院肿瘤医院、中山大学肿瘤防治中心、上海交通大学医学院附属瑞金医院、四川省肿瘤医院、浙江省肿瘤医院等几十家机构建立良好的合作关系，拥有大量的项目经验、专业的技术支持和强大的生信分析团队，确保一流的技术服务能力。

文章解读

根据多重IHC/IF所使用的技术原理，如下图2所示，可以将其分为(A)基于显色染料技术、(B)基于金属同位素技术、(C)基于荧光技术和(D)基于DNA barcode技术等四大技术平台。

图2

 基于显色染料的多重IHC/IF技术 

典型的代表是罗氏的DISCOVERY ULTRA，其原理仍然是经典的IHC的一抗捕获+二抗显色的结构，显色底物是类似DAB的显色染料，不过由于它们有较广的光吸收谱，会形成一种在光学显微镜下容易区分的深色染色图，如下图3所示。DISCOVERY ULTRA技术不需要另行购置配套的光学显微镜，使用常规光学显微镜即可进行原位表达分析，检测多重共定位靶标。但是它没有配套的分析软件进行定性或定量分析，多靶标的共定位结果分析有一定的难度。它的靶标检测通量相对较低，最多可以同时检测5个靶点。

图3

基于金属同位素的多重IHC/IF技术 

基于金属同位素技术的多重IHC/IF有两个代表性的平台，一个是成像质谱流式技术（Imaging mass cytometry，IMC），它依靠高分辨率的激光烧蚀技术和质谱流式技术的结合，理论上最高检测指标可达100个，根据目前可以用的同位素类型，实践中可以同时检测超过40重的靶标。IMC平台的缺点在于图形获取速度非常慢，以至于它是通过免疫荧光的显色图来选择特定区域进行分析的，如下图4所示为IMC的人组织显色图，对于一个1000um2的组织区域，需要耗时2h来完成数据获取 ，另外由于它是单抗体显色的平台，缺少二抗及后续的级联反应效应，它的灵敏度要比IF低，而且激光光斑的精度所限，它的分辨率设定为1um，比其他多重IHC/IF技术都要低。

图4

另一个比较代表性的技术平台是多重离子束成像技术（Multiplexed Ion Beam Imaging，MIBI），检测靶标数可达40-100个。它有一个配套的成像和分析软件平台MIBItracker Software ，可以在多个分辨率下进行重扫描，获得亚细胞定位信息，它不只是可以获取免疫细胞浸润、细胞形态和空间定位，同时也可以获得蛋白的定量表达结果。但是空间位阻和非特异性吸附依然是它的一个挑战，合适的染色和成像也有一定的难度，还有一个缺点是它的成本非常高昂。

 基于荧光成像的多重IHC/IF技术 

Vectra是一个基于免疫荧光的多重IHC/IF检测技术，通过多次染色循环，可以实现同时检测9个靶标如下图5所示。每一次染色循环后，需要洗去上一循环留下的染色标记，因此彻底清除多重染色循环间的检测残留是Vectra的一个挑战。这个技术是过去5年中最为广泛采用的多重IHC/IF技术之一，已经有医院和研究机构采用它作为临床检测平台以帮助临床医生进行临床诊断。现在已经有了很多自动化的染色设备如Leica Bond Max，一天可以完成30张七色病理切片的染色。

图5

 基于DNA barcode的多重IHC/IF技术 

基于DNA Barcode的技术主要包括两种，一种是非因DSP空间多组学技术平台，它的实现原理是依靠一个特殊设计的连接了DNA barcode的抗体，检测抗体与DNA barcode间通过一个紫外光解的连接子连接，可以在紫外光的照射下释放DNA barcode，对DNA barcode进一步的测定即可实现靶标的定量检测如下图6所示，同样的由于使用DNA barcode进行靶标的区分，突破了荧光图像的可用通道数的限制。通过选择合适的区域进行测定，可以实现空间蛋白组学的多重靶点的定量检测。DSP并不局限于蛋白靶点检测，也可以进行RNA靶标的检测，使用经过特殊设计的探针进行靶标吸附，相比传统的RNA-seq，DSP除了有空间定位信息外，还可以检测到低丰度基因表达数据。

图6

另外一个CO detection by indEXing (CODEX)技术也是依赖于多重染色技术实现多重靶标检测，其核心设计原理是每种抗体上标记特异性寡核苷酸“条码标签”(Barcode)，成像所需的荧光染料是通过和Barcode互补序列特异性结合，使得该技术突破可见光谱荧光成像通道数量的限制如图7所示。

图7

 结 论 

综上所述，新兴的多重IHC/IF技术在肿瘤免疫治疗领域具有广阔的应用前景。与传统的IHC只允许在组织样本中标记单一标记不同，多重IHC能够从单个组织样本中检测多个标记，同时提供关于细胞组成和空间排列的全面信息。我们相信在不远的将来，可以找到一个应用广泛、重复性高、周期短、成本低、标准化的多重染色技术定量方案，为癌症免疫治疗的转化研究和临床实践作出重大贡献。

非因小结

该综述梳理了当前多重IHC/IF技术领域的四类原理及相应的技术特点。这类技术以解决传统IHC的低靶标数、低可重复性的弊端为出发点，高靶标数的优势给了肿瘤免疫研究更深广的技术视野，可以更进一步的解析肿瘤内在的作用机制和发病机理，而高可重复性优势以高效精准的数据采集为肿瘤研究的可信度提供更高质量的保证，使得此类技术在肿瘤免疫领域的应用前景越来越广泛。