我的硝化综述

异养硝化研究进展

引言
随着工农业生产的快速发展, 氮肥的使用量逐年增加，过程中氮损失量达到27%-60%。氮损失是氮循环失衡的表现之一，会导致土壤肥力下降、水体富营养化、温室气体排放等一系列环境问题[1]。
亚硝酸氧化细菌催化硝化过程中的第二步，将亚硝酸盐转化为可被众多植物与微生物利用的硝酸盐，是氮循环与生物脱氮的重要一环[1, 2]。传统认为自养亚硝酸氧化细菌是自然界中硝化反应的主要承担者，但近年来的众多研究表明相较于自养亚硝酸氧化细菌，异养亚硝酸氧化细菌具有对环境的高适应力，更高的硝化效率，更短的培养时间等优势。然而仍有大量的异养亚硝酸氧化细菌处于未培养的状态并且对其的研究有限。此外，在目前的生物脱氮中，硝化过程的稳定性仍然是限制脱氮效果的主要因素。因此，更深入地研究硝化机制与特性对改进现有脱氮工艺有着重要意义。本文就异养亚硝酸氧化细菌的脱氮特性进行综述，并阐述了目前的研究现状与挑战。

1. 异养硝化菌的发现（略）
   硝化作用包括氨氧化古菌、氨氧化细菌介导的氨氧化与亚硝酸氧化细菌介导的亚硝酸氧化两个过程。由于多种因素，对异养亚硝酸氧化细菌的研究长期滞于其他参与氮循环的微生物[3]，但随着近年来检测手段的进步，异养亚硝酸氧化细菌在氮循环中的作用逐渐得到重视。此外，异养亚硝酸氧化细菌在添加外部碳源的情况下易成为优势菌、相对自养亚硝酸氧化细菌培养周期更短与能适应多种环境的优点，也使得异养亚硝酸氧化细菌在生物脱氮中应用广泛[4, 5]【缩写】。
   目前已从土壤、淡水、海水与高盐水体、热泉等多种环境中[6, 7]发现了众多展示出新特性的高效异养硝化菌，如以H2 、甲酸盐与硫化物等为代谢底物[7]或对极端条件的适应性[8]【详细举例】。这些亚硝酸氧化细菌分别属于Nitrobacter，Nitrotoga，Nitrococcus，Nitrospira，Nitrospina，Nitrolacea[9]和近年发现的“Candidatus Nitromaritima”[6]七类。

2. 硝化代谢途径（略）
   硝化作用是由一系列酶分步催化的。第一步（氨经氧化转化为羟胺）通过氨单加氧酶（ammonia monooxygenase，Amo）进行；第二步（羟胺转化为亚硝酸盐）分两步进行：首先，羟胺氧化还原酶（Hydroxylamine oxidoreductase，HAO）将羟胺转化为一氧化氮，之后另一种迄今未知的酶或者O2将一氧化氮转化为亚硝酸盐；第三步亚硝酸盐到硝酸盐的转化通常在亚硝酸氧化细菌中完成；亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，Nir）与呼吸型硝酸还原酶（Respiratory nitrate reductase，Nar）是通过反硝化途径补充氮库的重要一环[18]。
   

图1 氮代谢途径与过程关键酶
Figure 1 Proposed nitrogen metabolic pathway and key enzymes
异养硝化菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的关键酶是亚硝酸氧化还原酶（nitrite oxidoreductase，Nxr）。Nxr每氧化一分子亚硝酸盐就将2个电子转移至电子传递链中。在Nitrobacter中，Nxr是一个含有Fe-S中心的钼蛋白，位于细胞膜内侧以及胞浆内膜（intracytoplasmic membranes，ICM）上。Nxr催化的亚硝酸盐反应是可逆的，所以Nxr也能从有机化合物中获得电子以还原硝酸盐。目前已知NXR由2个α（NxrA）亚基，2个β（NxrB）亚基以及1个γ（NxrC）亚基组成，其中α亚基含有能与底物结合的钼蝶呤辅因子，β亚基和γ亚基分别含有传递电子的Fe-S中心与血红素 [19]。Nxr催化的亚硝酸氧化反应在一定条件下具有可逆性，迄今已发现众多同步硝化反硝化的异养亚硝酸氧化菌[11, 14]。
不同于Nitrobacter，在Nitrospira moscoviensis 中，Nxr的α亚基位于细胞膜外侧[5]。这种Nxr的朝向差异可能揭示了不同种属的异养亚硝酸氧化细菌对低浓度亚硝酸盐的适应力，同时也表明功能趋同的亚硝酸氧化细菌可能有着多种进化途径，包括不同微生物之间的基因转移。最初发现Nitrospira内Nxr有四个组成部分，其中两个组分分别与Nitrobacter的α与β亚基有很高的同源性，另两个未知[20]。但是就Nxr的两亚基的编码基因而言，不同种属硝化菌之间nxrB的差异远大于nxrA[21]。这种功能基因上的进化多样性为以nxrB为功能性分子标记结合宏基因组学技术高效地分析环境中的硝化微生物提供了可能性。

3. 亚硝酸氧化影响因素
   影响异养硝化特性的理化因素众多，其中研究较多的是pH、温度、溶解氧（DO）等。
   3.1. pH对硝化特性的影响
   迄今为止，关于pH对硝化作用的影响仍未达成一致的认识。因为其具有对中性至偏碱性pH的偏好性，传统认为中性或微碱性环境适于大多数硝化菌生长繁殖。Zhang等[22]通过响应面优化法发现N. Winogradskyi的最适培养pH为7.83。尽管有学者认为酸性土壤环境中未存在显著的硝化反应迹象[23]，然而也有研究表明在pH 3.0的土壤中存在不弱于中性土壤的硝化作用[24]。
   游离氨能抑制异养硝化细菌的硝化活性[25]，而环境中（如水体、土壤或培养基等）pH的改变能促使游离氨溶解状态的变化。Poot等[25]的研究显示，硝化颗粒表面与中心0.4的pH差，导致了颗粒由外侧到内侧递减的NH4+浓度分布，而较高的NH4+浓度提高了表面氨氧化细菌的硝化效率，颗粒中心的低NH4+减少了对亚硝酸氧化细菌的抑制作用。刘灵婕[26]等发现FA对氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌菌群的临界抑制浓度分别为8.1 mg·L-1和6.6 mg·L-1，表明亚硝酸氧化细菌相对于氨氧化细菌菌群对游离氨更敏感。而对Nitrospira和Nitrotoga共存的生物膜反应器进行群落分析发现，弱酸性pH与较低温度相结合更有利于后者的生长[27]。这些研究不仅对研究亚硝酸氧化细菌硝化机制有重要意义，也为脱氮工艺的改进提供了参考。

3.2. 温度对硝化特性的影响
温度对亚硝酸氧化作用的最大速率（Kmax）和硝化率（%）有着显著影响。大多数异养硝化微生物最适培养温度为28～37℃[22, 28]，同时在最适温度范围内，硝化率