重组蛋白昆虫表达的优势和载体选择

最新推荐文章于 2025-05-05 16:51:45 发布

蛋白界小百灵

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1.重组蛋白昆虫表达系统简介

昆虫杆状病毒表达系统（重组蛋白昆虫表达系统）以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为宿主，进行基因组自我扩增并且完成目的蛋白表达，被广泛用于生物研究领域[1]。

昆虫杆状病毒表达系统的原理主要包括病毒侵染昆虫细胞、病毒DNA复制、外源基因插入和表达等步骤[2]。昆虫杆状病毒通过其表面的受体与昆虫细胞表面受体结合并进入细胞，病毒DNA被释放并复制，形成大量的病毒DNA分子。并通过同源重组等方法将外源基因插入到病毒DNA中，外源基因随着病毒DNA的复制而复制，并在细胞内表达出外源蛋白。

2.重组蛋白昆虫表达的优势

（1）杆状病毒表达系统表达的重组蛋白具有完整的生物学功能，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白；

（2）昆虫细胞可对外源蛋白进行翻译后修饰作用[3]（如糖基化、磷酸化、乙酰化等）；

（3）昆虫细胞可进行悬浮培养，且容易在无血清培养基中存活，易实现大规模低成本生产；

（4）杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段；

（5）BEVS在动物病毒VLP研究中应用广泛，由其生产的疫苗在医药审批程序上有望通过绿色通道获得更快的审批途径。

3.重组蛋白昆虫表达的载体选择

常用的杆状病毒AcMNPV的基因组较大，目的基因导入后难以通过常规分子克隆手段实现。目前常用的方法包括3种：在昆虫细胞中的同源重组、在大肠杆菌中以转座子介导的重组以及目的基因体外重组到病毒基因组。

（1）昆虫细胞中的同源重组

细胞内重组方式即使用转移载体和亲本杆状病毒共感染昆虫细胞，使外源序列通过与亲本杆状病毒基因组之间的同源序列发生重组，从而得到重组病毒[4]。可在杆状病毒基因组ORF603与ORF1629中加入多个Bsu36Ⅰ酶切位点，从而得到去除了某些复制必需片段的线性亲本杆状病毒，使感染细胞后含有目的片段的重组杆状病毒的比例高达约90%，BaculoGoldTM即采用这种方式。后续部分商业化试剂盒如BacMagicTM与flashBACTM又将必需片段ORF1629删除，并用细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)取代ph结构基因。当其与携带有目的基因的转移载体共转染昆虫细胞后，转移载体上的外源基因就会组装到ph启动子的下游，移除BAC并恢复ORF1629的基因功能。

（2）大肠杆菌中转座子介导的重组

该系统中的病毒基因组经过改造后（称为杆状病毒穿梭载体Bacmid），能够在大肠杆菌如DH10Bac菌株中复制，通过供体质粒中目的基因的两侧锚有Tn7转座原件，借助DH10Bac菌株中helper质粒编码的转座酶活性，将目的基因转座到bacmid特定位点上，目的基因的插入会导致bacmid上的LacZ基因产生移码，进而通过蓝白斑筛选鉴定出阳性重组bacmid，提取后转染昆虫细胞。该方法的优点是蓝白班筛选结合后续的PCR鉴定手段稳定性好，阳性率接近100%，基于此类的BEVS有Bac-to-Bac、MultBac等。

（3）体外重组

目的基因体外重组到病毒基因组的商业化系统比较少，常见的是BaculoDirect系统。该系统结合Gateway克隆技术，将attR序列整合到线性化的杆状病毒基因组中，而供体质粒上目的基因两侧带有attL序列。只需简单地将初步克隆与BaculoDirect线性DNA和Gateway LR Clonase酶进行混合，室温孵育1小时，之后转染至Sf9或Sf21昆虫细胞即可进行重组病毒的制备。该系统的优点是方便快速，但缺点显而易见，需要实验室配套Gateway克隆生态，成本较高。

参考文献

[1] Kong M, Zuo H, Zhu FF, et al. The interaction between baculoviruses and their insect hosts. Dev Comp Immunol, 2018, 83: 114–123. DOI: 10.1016/j.dci.2018.01.019

[2] Liu YP, Wang FH, Sun ZJ, et al. Progress of studies and application on baculovirus expression vector system. Chin Bull Entomol, 2006, 43(1): 1–5. (in Chinese).

[3] King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, et al. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. London: Elsevier, 2012.

[4] Blissard GW, Rohrmann GF. Baculovirus diversity and molecular biology. Annu Rev Entomol, 1990, 35: 127–155. DOI: 10.1146/annurev.en.35.010190.001015