MicroRNAs在HBV阳性肝细胞癌免疫耐受形成中的功能及机制研究

目的乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范围内造成了重大的公共卫生问题,而全世界超过四分之一的感染者在我国。据有关统计数据,国内肝病约90%都与HBV的感染有关。HBV感染不仅能够在细胞水平上增加肝癌恶性程度,还能够促进肿瘤微环境和机体整体免疫状态进一步走向耐受,抵抗机体免疫系统对病毒和癌细胞的清除。深入研究HBV感染在HCC发生过程中的功能及机制,并找到关键分子或信号通路,对打破肝癌免疫耐受,增强机体抗病毒抗肿瘤免疫应答的能力,并最终清除肿瘤细胞具有重要理论及临床意义。HBV是一类较小、包被完整的DNA病毒,能够导致急性或持续性的肝脏感染。临床研究发现,长期慢性HBV感染可能进一步引发肝炎、肝硬化甚至肝癌的发生。HBV阳性的HCC肝癌组织往往处于一种免疫耐受状态,即免疫活性细胞对肝癌细胞表现出异常的无应答状态,使肿瘤细胞无法被清除,从而逃避免疫反应。人白细胞抗原-G (HLA-G)是一类非经典的MHC-I类分子,能够与免疫细胞表面的抑制性受体结合,向胞内传导抑制信号,属于一种免疫耐受分子。前期研究发现,HLA-G分子在胃癌、肺癌等肿瘤细胞中也有高表达,并对肿瘤细胞的免疫逃逸具有重要作用。HLA-G分子可能成为肿瘤细胞的新的分子标志。微小RNA(miRNAs)是在真核生物中发现的一类小分子非编码单链RNA,能够特异性地与靶mRNA分子的3’端非翻译区(3‘UTR)不完全互补结合,抑制其翻译过程。miRNA在细胞分化,生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。大量的相关研究从不同层面上揭示了在肝癌的发生发展过程中,miRNA表达谱也发生了显著而广泛的变化,而且具有一定组织特异性,提示miRNAs的差异表达可能在肝细胞癌变的病理过程中引起非常重要的表观遗传改变。然而已有的研究大量集中在对肝癌各种类型,不同分期,以及患者病灶组织、血液等标本中miRNA基本表达情况的检测和与疾病进展、预后等的相关性分析,而纵向的分析特定miRNA在这一过程中,特别是在HBV阳性HCC的病程中具有确切作用的报道还相对较少,远不能满足临床寻找和开发新的临床诊断、预后乃至治疗的潜在靶点的需求。本研究瞄准国家重大传染病防治的迫切需要,从免疫学和表观遗传学的角度去探索HBV致病,特别是免疫致病过程中可能的新的细胞和分子机制,采用免疫组织化学和实时定量PCR的方法检测了临床HBV阳性肝细胞肝癌病理组织中HLA-G及其相关miRNA的表达,发现HBV感染能够上调HLA-G的表达,并与miRNA-152的表达呈现明显相关性。这一现象在HBV基因组整合的肝癌细胞系HepG2.2.15和其对照细胞系HepG2中进行了体外验证,证实该特异性miRNA在HBV感染后的低表达参与了HLA-G的表达上调,通过‘’HLA-G-ILT"相互作用抑制了NK细胞介导的对肿瘤细胞的杀伤,抑制了天然免疫系统对肿瘤细胞的清除,促进了免疫逃逸。方法1.收集经病理组织学确诊的肝癌组织(分HBV+/-两组)及癌旁正常组织标本,免疫组织化学染色法检测HLA-G蛋白表达；2. TRIzol法提取肝癌组织细胞总RNA,用miRNA提取分离试剂盒提取miRNA, Real-time PCR检测miR-148a、miR-148b、miR-152及U6等基因表达情况；3. RT-PCR、FACS、Western Blot法检测HLA-G在HepG2、HepG2.2.15细胞系的表达；4.MTT法检测NK-92细胞对HepG2、HepG2.2.15细胞的杀伤能力；5. Real-time PCR检测miR-148a、miR-148b、miR-152在HepG2、HepG2.2.15细胞系中的表达；6.脂质体转染法将HBV表达质粒及对照质粒转入HepG2细胞,RT-PCR和Western Blot检测HLA-G表达,Real-time PCR检测miR-148a、miR-148b、miR-152表达；MTT法检测NK-92细胞对HepG2-HBV细胞的杀伤能力；7.脂质体转染法将miR-148a、miR-148b、miR-152mimics分别转入HepG2.2.15细胞中,Real-time PCR、Western Blot法检测HLA-G的表达,MTT法检测NK-92细胞对HepG2.2.15细胞的杀伤能力。结果1.临床肝癌组织化学染色法检测发现,HBV阳性肝癌组织中HLA-G的表达明显高于HBV阴性肝癌组织,癌旁正常组织不表达HLA-G;而定量PCR分析显示,：mRNA-152在HBV+HCC组织中的表达低于HBV-HCC组织,差异具有统计学意义(P<0.05)；2. HLA-G在HBV阳性肝癌细胞系HepG2.2.15中的表达高于HBV阴性肝癌细胞系HepG2;3.NK-92细胞对HBV阳性肝癌细胞HepG2.2.15的杀伤能力低于对HepG2细胞的杀伤；4.miR-148a、miR-148b、miR-152在HBV阳性肝癌细胞系HepG2.2.15中的表达低于在HepG2细胞中的表达；5. HepG2细胞过表达HBV后,HLA-G表达上调,miR-148a、miR-148b、miR-152表达下调,NK-92细胞对其杀伤活性降低；6. HepG2.2.15细胞过表达miR-148a、miR-148b、miR-152后,HLA-G表达下调,NK-92细胞对其杀伤活性增高。结论本课题关注于HBV感染相关的肝细胞癌发生中免疫抑制分子HLA-G的异常表达,研究了miRNAs在HBV对HLA-G表达调节机制中的作用,初步探讨了HBV引起肝癌免疫耐受的机制。根据上述实验结果,本研究发现,HBV感染能够上调HLA-G的表达,而HLA-G的表达上调对于肝癌肿瘤细胞逃避免疫清除具有重要作用,此过程中miR-148a/148b/152具有重要调节作用。这预示HLA-G和相关miRNA可能成为肝癌诊断和治疗的新的生物学标记,可能会给疾病治疗提供一种新的手段。本研究从miRNA的层次揭示了HBV感染引起的肝细胞癌免疫抑制的新机制,从表观遗传学角度分析了参与HBV相关HCC免疫逃逸的关键分子或信号通路与特异性miRNA之间的关系,对进一步打破肝癌免疫耐受,增强肿瘤细胞的清除能力具有重要理论及临床意义。