DNA测序的双脱氧链末端合成终止法

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其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

      在测序用的缓冲液中含有四种（2-脱氧的）dNTP及聚合酶。测序时分成四个反应，在每个反应中除上述成分外分别加入2，3-双脱氧的A，C，G，T核苷三磷酸ddNTP （即ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP）。在第一个反应物中，ddATP会随机地代替dATP参加反应。一旦ddATP加入新合成的DNA链，由于其3位的羟基变成了氢，所以不能继续延伸。第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了；同理，第二个反应产生的都是以C结尾的，第三个反应的都以G结尾，第四个反应的都以T结尾，电泳后就可以读出序列了。

例：-GATCCGAT-。

在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段：GA，GATCCGA,

在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段：GATC，GATCC,

在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段：G，GATCCG

在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段：GAT，GATCCGAT

电泳时按分子量大小排列，A反应的片段长度为2和7。C反应的为4和5。G反应的为1和6。T反应的为3和8。