四十而不惑——DNA测序技术的前世今生和未来

生信技能树

自上1953年DNA分子双螺旋结构被发表以来，生物学研究进入到了一个更精细化的分子时代，越来越多的科学家开始投入分子生物学研究，尤其是对DNA序列的研究，从而DNA测序技术应势而生。从1977年Sanger牛刀小试的双脱氧终止法到近十年如日中天的高通量测序技术，再到目前蓄势待发的三代单分子测序技术，这跨越近40年的风雨历程，

DNA测序是指测定和分析特定DNA片段中，碱基序列的排列情况。被广泛应用于生命科学和临床医学等领域的研究，如分子生物学，遗传学以及临床诊断，法医生物学等。而DNA测序技术自1977年sanger等人的双脱氧终止法到今天的单分子纳米孔测序法，已有40年的历史了。

这篇2017年10月发表在nature上的综述，回顾了DNA测序技术发明40年来的发展历程，并对DNA测序技术的现状及未来做了总结和展望。从最初几个碱基对到第一个人类基因组，这中间经历了多个技术革命和增长，如现在获得的百万人和无数其他多种的基因组等。我们预测，从长远来看，DNA测序创新将与显微镜的发明一样，影响深远。

DNA测序技术的历史

• 早期测序：
  早在DNA测序技术被发明之前的1953年，就有胰岛素蛋白（insulin protein）被测序了；而后的1965年，tRNA（alanine tRNA:丙氨酸tRNA ）也已经完成了测序，其中，第一个RNA测序用了140kg的酵母测出了76个核苷酸；在1968年，噬菌体λDNA的结合末端 （cohesive ends of phage lambda DNA）被测序完成。

在早期测序中，被测序的序列大多采用了类似的思路：将序列分离（色谱或电泳），分解成小片段（RNases或蛋白酶），然后破译每个小片段，并将片段重叠，最优由重叠部分推导出序列。

• DNA测序技术的发明：

1973年，Gibert和Maxam使用引物延伸法测定了24个乳糖抑制因子结合位点的碱基（先将其复制成RNA，再测序），整个工作进行了两年时间，相当于每个核苷酸需要耗时一个月。

1976年，Sanger和Coulson开发的双脱氧链终止法；Gibert和Maxam发明的化学裂解法。这两种方法都是通过产生不同长度的片段（链终止合成或化学切割），然后都用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定了每个碱基反应中存在的片段的大小，并通过单碱基分辨率分离出DNA片段，将每个碱基一条标记的凝胶放置在X射线胶片上，产生一个梯形图像，从中即可读取该片段的序列，按照大小上升四条标记，