dynamo使用教程

官方指南：
Starters guide
Starters guide (workshop version)
其他教程：
teamtomo.org
Youtube：
Dynamo package for cryoET - Daniel Castaño-Diez - I2PC Seminar Series in electron tomography 2021 - YouTube
Session 1. Basics of sub-volume averaging with Dynamo - YouTube

Starters guide (workshop version）

1 Manual particle picking and Dynamo catalogues

Dynamo catalogues 是管理 tomograms 的数据库，并将层析图数据与提取的颗粒联系起来。

通过输入以下命令启动目录管理器：

dcm

在 catalogue manager 打开后，我们以以下方式创建3个 synthetic tomograms，其中包括我们的粒子(热体 thermosomes):

您可以在 catalogue manager 底部的一个表中看到 tomograms 及其元数据的列表。

在处理自己的项目时，您可以通过 Catalogue -> Browse for new volume 将断层图添加到目录中。tomograms 位于目录 testcatalog 中。它们包含少量的噪声和一个与y轴旋转有关的缺失楔。

我们在名为 testcataloge_withmodels 的附加目录中添加了关于 tomograms 中粒子位置的信息。如果需要，可以使用Catalogue -> look for local catalogues在目录管理器窗口中查找。

1.1 Viewing tomograms

选择列表中的第一张层析图，进入View volume>Full tomography file in tomoslice。

卷浏览器 tomoslicer 将整个 tomograms 加载到内存中，并允许对感兴趣的区域进行注释。

本教程中的层析图很小，您可以将它们直接加载到内存中。对于现实生活中的断层图，请记住，在将文件加载到内存之前，您需要预先保存这些文件。

Tomoslice有一组简单的控件，适用于需要通过断层扫描进行斜切片的可视化任务。它使用与其他Dynamo浏览器相同的工具来跟踪您的注释：a pool of models。您可能需要调整对比度(蓝色箭头)。要在层析图切片中移动，您可以使用鼠标滚轮，上下单击并拖动层析图切片(橙色箭头)，或者左右移动位置控件(橙色框)。

1.2 Picking and extracting particles in tomograms

在断层图中选取和提取粒子

拾取粒子的坐标由称为模型的数据类型表示。在建模器窗口( tomoslicer window)中，转到Model Pool -> Create new model in pool (choose type) -> General。这是最简单的模型类型，其中每个 clicked/model point 对应于单个孤立的粒子。

现在你可以上下浏览断层图，把鼠标放在粒子的中心，按键盘上的[c]键来添加一个新的模型点。(注意Help -> all hot keys选项列出了不同按键的不同操作)。退格键删除最后单击的点(您也可以使用右键单击删除单个点)。

当你完成了大约10个粒子点击活动 Active model > Update Crop points在 tomoslice window

通过Active model -> Save Active model into catalog(disk)将模型保存到目录中，并关闭 slicer window。

为 tomograms 2和3选择粒子。总的来说，在生成的数据集中大约有30-40个粒子。

当您打开一个新的断层图时，请确保在被要求时从内存中删除模型池。这对存储在磁盘中的模型没有影响，并且为了确保您没有混合来自不同层析图的模型，这是必要的。

1.3 An alternate visualization: orthogonal projections

点击菜单上的Projection -> project full shown fragment along z (仍然在dtmslice)，你会得到一个屏幕，其中x-y投影的 tomogram 显示。

使用二次点击来启动横过该点的x-z和y-z平面的正交视图。这些视图也可以用来点击粒子，以防标准视图不够用。

2 Extracting particles from tomograms

在目录管理器窗口中，选择要从中提取粒子的断层图行。您可以使用鼠标单击并按住[ctrl]键逐个选择它们，或者单击Select all 按钮。然后，转到Crop Particles -> Open Volume List Manager。

将打开一个新窗口，底部列出目录中的所有型号。选择(通过复选框)您刚刚单击的general类型的模型。点击Create list ，然后Crop particle。

在新窗口中，将数据名称更改为有意义的名称，例如thermosomeParticles，将边长从32更改为48，然后单击start cropping。

裁剪完成后，通过点击ddbrowse(在上面的窗口中)来浏览裁剪后的粒子。打开一个新窗口，您可以简单地单击show。

您可以看到所有裁剪的3D subtomograms的2D表示(投影)。确保你的粒子是很好的中心和 fit the box。

我们还引入了dynamo table的概念:关于每个粒子的信息存储在表中。每个粒子在表中都有一个条目，包含移动和旋转来描述它的方向(默认情况下，这些值初始化为零)。它还包含粒子ID(标签)，missing wedge 的方向和其他。要获得完整的信息，请键入命令dthelp。Dynamo目录在粒子提取过程中生成一个初始表。 Its location is in particles/crop.tbl.

3 Subtomogram alignment and averaging

3.1 Initial reference generation

我们希望将提取的层析图对齐到一个公共参考。
为此，我们需要一个 initial reference （稍后将在迭代校准期间进行细化）。在这里，我们通过手动对齐一些粒子并平均它们来创建这样一个初始参考。我们使用命令dgallery为一些将用于生成初始参考的粒子生成初始方向。关闭所有打开的Dynamo窗口，并在Dynamo命令行中输入：

dgallery('data','thermosomeParticles.Data');

点击load加载内存中的所有粒子，移动shown bar 显示粒子，使用x-， y-和z-按钮可以看到不同的视图：

要手动对齐粒子，请对大约10个粒子执行以下操作：

1. 将鼠标放在粒子中心并按下[c]键（这将使粒子居中）。
2. 将鼠标放在其顶部(或底部)部分并按下[n]键（这将对齐粒子）。
3. 点击粒子，确保它的数字从红色变为蓝色（蓝色表示它被选中进行进一步处理）。要取消选择粒子，请使用右键单击。

如果需要，在x, y和z视图之间更改以纠正方向。这样做只是为了创建一个初始引用，所以方向不需要非常精确。

通过单击右上方的quick save按钮保存选中的标签和相应的表。它保存quickbuffer.tbl 和 quickbuffer.tags。标记到稍后将使用的硬盘驱动器。为了生成平均值，你需要在粒子上应用表格。为此，单击粒子选择字段中的average按钮。

它会打开一个带有许多控件的新窗口。单击窗口底部的compute average。然后，右键单击输出文件名并在下一个窗口中单击ok以查看结果。如果你对结果不满意，关闭窗口并改进你的手动对齐和/或添加更多的粒子到平均值。

3.2 Alignment projects

subtomograms 与其平均值的迭代对齐是由可以在各种高性能计算环境中运行的 dynamo 项目执行的。要运行对齐项目，您需要粒子、初始参考和表。所有这些文件都是我们之前生成的。通过键入启动对齐项目GUI：

dcp

在新窗口中，执行以下操作:

1. 添加项目名称drun1，按enter键并在弹出窗口中选择create a new project。
2. 点击粒子并提供粒子文件夹名称
   thermosomeParticles.Data，单击ok。
3. 单击表格并提供表格名称
   thermosomeParticles.Data/crop.tabl，单击ok。
4. 单击模板并提供初始引用名称my_average.em。单击ok。
5. 点击蒙版，只需点击use default masks。单击ok。你也可以指定椭球蒙版的半轴，或者去Mask editor制作更复杂的蒙版。注意Dynamo默认使用Rossman相关，它消除了与硬(非软)掩码相关的工件。

点击数值参数numerical parameters来设置关于校准项目的不同迭代的所有参数和细节。您可以用鼠标选择表中的任何参数，然后单击?参数窗口右上方的按钮，以查看参数的说明。需要考虑的最重要参数是:

• Number of iterations：进行3轮，每轮2次迭代。第一轮将是一个具有粗糙角度步骤的全局搜索，接下来的几轮将用于细化。
• Angular search ranges：圆锥孔径是表中定义的初始方向周围的前两个欧拉角的扫描范围。360度是整个扫描范围。方位旋转范围定义了围绕粒子的新垂直轴的旋转范围。
• High- and lowpass values：傅里叶体素来限制使用的频率范围。
  粒子尺寸:定义为子体积的边长。如果你设置一个较低的值，粒子将在特定的回合中被下采样。这将加快这一进程。
• Refine：在每次角度扫描后，搜索步骤被细化因子减少。这是重复的精炼次数。也就是说，如果你的锥体采样是10度，细化是3，细化因子是2，那么10度，5度，2.5度和1.25度将被采样。这是角搜索空间的优化。
• Shift limits：限制粒子从框中心移动(如果移动限制方式为1)或从先前估计的中心移动(如果移动限制方式为2)。先前对移动和旋转的估计来自输入表，并在每次迭代结束时更新。
• Symmetry：如果你知道你的蛋白质的对称性，它将加快收敛，并得出更高的分辨率。
  按如下参数配置，单击“ok”。
  

单击Computing environment并选择您的计算环境（如果您在研讨会期间使用独立版本，请选择standalone）。设置CPU核数和并行化平均步长到最大可用（例如 24）。其余部分保持原样，然后单击ok。在对齐GUI中单击check并unfold。要运行项目：

• 在Matlab会话中，您只需点击“run”即可。
• 在一个独立的项目中，打开一个新的终端，加载Dynamo(但不运行它)并通过键入./drun1.exe来运行项目更方便。（博主建议使用此方法和下面的命令来运行和查看）

当项目运行时，打开另一个Matlab窗口（或在独立打开另一个运行Dynamo的终端），您可以通过输入来监控对齐项目的进度:

dvstatus drun1

当项目运行时，您可以通过输入以下命令查看中间结果的投影：

ddb drun1:a:ite=* -j c10

或者输入最新的平均值:

ddb drun1:a -v 

最终结果应该类似于：

4 Subtomogram classification

为了演示分类示例，我们提供两种大小稍有不同的颗粒。然后我们可以用简单的多参考分析（Multi-reference Analysis，MRA）对它们进行分类。要做到这一点，我们首先生成一个有2个粒子群的数据集。为此，输入：

dynamo_tutorial('data_classification','M',8,'N',8);

它生成两组粒子，每组8个粒子，包括它们的表。

MRA背后的思想如下：
粒子与几个参考对齐（这里只有2个）。每次迭代后，每个粒子只分配给一个最适合它的参考。这个过程是反复重复的。相似的粒子与相似的参考有更高的相关性，最终会聚集在一起。为了将其分类为N个类，我们需要N个初始参考和N个初始相同的表。按照以下步骤运行MRA：

1. 通过在 alignment GUI的项目名称中输入“drun2”来创建一个新项目。
2. 将引用数设置为2。
3. 激活Swap particles 按钮。
4. 转到particles并在particle data中添加data_classification/data。单击ok。
5. 转到table 并在clone this中输入data_classification/real.tbl进入并按下copy。单击ok。
6. 进入template，clone this file → data_classification/original_template.em加上一些额外的噪声，振幅为1。
7. 点击masks ，点击use default masks。单击ok。
8. 单击numerical parameters，设置以下参数。单击ok。
   
   选择与前面对齐项目中相同的计算环境，并以相同的方式运行项目。MRA项目通常运行时间更长，因为每个粒子将与两个引用对齐。然而，在这里，我们以一种过程仍然快速的方式选择参数(例如，小维度)。与之前一样监控项目进度：

dvstatus drun2

并使用命令可视化结果：

ddb drun2:a:ref=* -j c5

你应该得到两个平均值，其中一个类的粒子略大于另一个类。