文献阅读---多年生黑麦草种质中与耐热性相关的生理性状、分子标记和叶绿素分解代谢基因的自然变异

文献阅读—多年生黑麦草种质中与耐热性相关的生理性状、分子标记和叶绿素分解代谢基因的自然变异

本文献于2020年11月发表
杂志：BMC Plant Biology

1. 研究背景

（1）多年生黑麦草简介
a.起源
多年生黑麦草（Lolium perenne L.）又名英国黑麦草、冬黑麦草或射线草，属于单子叶禾本科冷季型牧草，原产于欧洲、亚洲和北非，目前在全世界都有分布。

b.植株形态
多年生黑麦草植株低矮、丛生、无毛，具有聚束（或分蘖）的生长习性。叶子深绿色，下表面光滑有光泽，上表面平行边无齿，平行叶脉突出。叶子在芽中纵向折叠（不像意大利黑麦草，黑麦草的卷叶），中央龙骨坚固，外观扁平。叶舌非常短且被截断，通常很难看到。小的白色耳廓抓住叶片基部的茎。

花序是不分枝的，在交替的侧面上带有小穗，边缘在茎上。与意大利黑麦草不同，每个小穗只有一个颖片，在远离茎的一侧，有 4 到 14 朵没有芒的小花。花药是淡黄色的，植物从五月到十一月开花。多年生黑麦草有须根系，主根粗，侧枝细。根通常是丛枝菌根。

c.生长习性
多年生黑麦草喜温凉湿润气候，宜夏季凉爽、冬季不太严寒地区生长。难耐-15℃的低温，10～27℃均能适宜生长。35℃以上易枯萎死亡。不耐荫，能耐湿，不耐旱，夏季高温干旱对生长极为不利，喜肥不耐瘠，适宜在排水良好、湿润肥沃、pH值为6～7的土壤上栽培。

（2）本研究背景和目标
前言思路：
1）提高耐热性是冷季草种育种改良的主要努力之一，了解其遗传多样性以及耐热胁迫耐受性的生理和分子因素，以培育耐热品种。（介绍背景）
2）使用表型性状和分子标记了解遗传结构和表型多样性是育种中性状改进的亲本选择的基础，例如耐热性。在耐热性冷季牧草育种的情况下，与耐热性密切相关的生理性状的信息仍然很大程度上不清楚。（引出多年生黑麦草耐热性信息研究不足）
3）已经开发了与表型和生理特征相关的分子标记，以了解遗传多样性并预测给定种质或育种材料的理想特征，与耐热相关的分子标记将在多年生冷季草种中开发。（引出分子标记的作用）
4）总结多年生黑麦草的重要性，本研究目的是了解多种多年生黑麦草的生理特征并确定与耐热性相关的分子标记。这些知识对于多年生黑麦草和其他冷季草种的耐热育种意义深远。（引出本研究的目的和创新性）

鉴定热胁迫和相关形状的遗传多样性对提高冷季型草坪草的耐热性至关重要。
本研究的目的是确定：

（1）多年生黑麦草材料中热胁迫下表型和生理性状相关的遗传变异
（2）多年生黑麦草材料中耐热性分子标记挖掘

（图片来自https://www.wikiwand.com/en/Lolium_perenne）

2. 研究方法

2.1植物材料

该研究使用98份多年生黑麦草种质材料（来自USDA），其中37份材料野生种质，33份栽培材料和28份不确定品系材料。
每个种质单个种子种植在13*13的塑料盆中，之后，材料通过分蘖繁殖成种质圃或库存植物（stock plants）。

本试验中，每个材料移植到8个盆中（每盆10个分蘖），这些都来自上面的种质圃（stock plants），并保持在 25/20 °C（昼夜温度）、70% 相对湿度、光周期的生长室中，光合有效辐射750 μmol m− 2 s− 1，持续60 d。
通过每周修剪和每周用半强度的霍格兰营养液施肥，将植物保持在 12 厘米的高度。

2.2温度处理

每个材料种植8盆，其中4盆重复用于常温条件（25/20摄氏度的白天/黑夜），4盆重复用于高温处理（35/30摄氏度的白天/黑夜）。植物栽培24天，处理期间植物接受定期相同的水肥处理。（只有温度条件不同）

2.3表型和生理数据测量

1）叶宽 (LW)测量，使用游标卡尺测量每个种质的 10 片成熟叶。
2）最大植物高度 (PH) 是手动测量的，作为从每株植物底部到顶部的长度。（maximum plant height）
3）植株质量（turf qaunlity，TQ） 使用基于植物颜色、枝条密度和均匀度的 1-9 等级进行目视评估，以评估整体植物的健康和活力（1 代表棕色和死亡植物，9 代表所有这些质量成分中最好的植物）
4）Fv/Fm 使用 Oxborough 和 Baker (1997)先前描述的荧光计 (Dynamax, Houston, TX, USA) 测定。
5）Chl 含量根据 Arnon (1949)的方法测量
6）相对含水量（relative water content，RWC）定量，将约0.1 g新鲜叶子分离并立即称重为鲜重（FW），然后浸泡在蒸馏水中并在黑暗中保持在4摄氏度下24 小时并称重为膨体重量（TW）。然后将叶片样品置于 80摄氏度的烘箱中 72摄氏度，然后称量干重 (DW)。 RWC 的计算公式为：
(FW-DW)/(TW-DW) × 100%
7）使用便携式光合作用系统 (Li-COR6400, LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA)测量 Pn 和 WUE。
8）EL 的定量，收集大约 0.2 g 的叶子，用蒸馏水冲洗 3 次，然后放入装有 30 ml 蒸馏水的 50 ml 管中。在摇动 24 小时后，使用电导率计（YSI Model 32，Yellow Spring，OH）对初始电导率 (Ci) 进行量化。将样品高压灭菌 30 分钟。在管冷却至室温后测量最大电导率 (Cmax) 相对 EL 计算为 (Ci/Cmax) × 100。
9）使用 2,3,5-三苯基氯化四唑 (TTC) 还原法测量 RA

2.4材料综合耐热性排序

1）PCA进行材料耐热性排序
使用PCA主成分分析对98个材料进行耐热性排序，遵循 Liu 等人 描述的用于对不同草基因型的干旱和盐分耐受性进行排序的方法。
PCA排序值：
∑nj=1𝑛𝑗（j=1…n）[𝑃𝐶𝑗PCj×𝑐𝑜contributionPC𝑛𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛𝑜𝑓𝑃𝐶𝑗(%)] (𝑗j=1…n)

“PCj”代表主成分 j 的值，“PCj 的贡献（%）”代表主成分 j 可以解释的对应力处理的响应方差。当前几个PC 的总贡献高于 85% 时，选择这些 PC 进行 PCA 排名计算 [43]。随后根据其 PCA 排名值对 98 个多年生黑麦草种质的相对耐热性进行排名。

2）热胁迫指数代表生理数据
不同种质间各生理值的绝对值不能如实代表其耐热程度。例如，热应激后叶绿素含量低的种质无法判断这种低含量是由于应激还是由于其他因素（例如，即使没有热应激也可能很低）。因此，我们使用相对值热胁迫指数（HSI）来进行应力耐受性评估[26]：

HSI = （热胁迫条件下的参数值）/（控制条件下的参数值） × 100

2.5遗传多样性、关联分析

1）标记筛选
使用多年生黑麦草全基因组66对SSR引物对98个材料进行基因分型（genotype）。引物通过PCR扩增，PCR 产物在 ABI 3730 DNA 测序仪（Applied Biosystem, Inc., Foster City, CA, USA）中分离。等位基因由 GeneMarker 1.6 软件 (SoftGenetics, LLC, State College, PA, USA) 鉴定。

具有至少 2 bp 差异的等位基因带被认为是种质间的多态性。所有确认的多态性等位基因都用于聚类分析。

2）聚类分析和关联分析
Nei 在种质之间的遗传距离是通过 PowerMarker 软件 3.25 版的“系统发育”功能基于 SSR 标记数据估算的。然后将 Nei 的遗传距离用于聚类分析和通过 FigTree 版本 1.4.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) 生成 Neighbor Joining (N-J) 树状图。使用 TASSEL 5.0 软件和通用线性模型 (GLM) 程序 对 SSR 标记与耐热性状进行关联分析。 P ≤ 0.01用于识别显著关联。

3. 研究结果和结论

1). 98份多年生黑麦草的耐热性评价

7 个生理性状（WUE、Pn、RA、Chl 含量、RWC、EL 和 Fv/Fm）和 3 个表型性状（TQ、LW 和 PH）用于评估 98 个多年生黑麦草种质的耐热性（补充材料 1）。

对多性状进行聚类可以划分a，b两类，这两类可以将对照材料和热胁迫材料分开。
用于聚类的10个性状可以聚类四个（I，II，III，IV），其中有两个性状的III类中趋势不明显(plant
height and leaf width)，因此剔除，使用其余8个性状用于后续分析。

性状缩写Abbreviations:
WUE, water use efficiency; Pn, photosynthesis rate; RA, root activity; Chl, chlorophyll content; RWC, leaf relative water content; Fv/Fm, photochemical efficiency; PH, maximum plant height; LW, leaf width

2). 98份多年生黑麦草的综合耐热性排名

基于 HSI 的 98 个种质的耐热性变化的 PCA 分析确定了总共八个主要成分（PC 1-8）。第一个 PC（PC1 到 PC4）的总和解释了总方差的 88.45%，其中第一组分和第二组分PC 是主要的，分别解释了 98 个黑麦草种质中 52.67% 和 20.37% 的方差（补充表 1）。

PC1值 = 0.897 × TQ + 0.766 × Fv/Fm + 0.858 × Chl含量+ 0.373 ×0.+24Pn + W Pn + W (− 0.691) × EL + 0.891 × RWC + 0.785 × RA；
PC2值=（ - 0.199）×TQ +（ - 0.311）×fv/fm +（ - 0.055）×CHL含量 + 0.809×PN + 0.896×WUE +（ - 0.043）×EL +（ - 0.180）×EL +（-0.180）×RWC + RWC + RWC + RWC + RWC +（-0.043） 0.040 × RA；
PC3值= 0.196×TQ+0.413×FV/FM+（ - 0.119）×CHL含量+0.233×PN+0.033×WUE+0.566×EL+0.095×RWC+（-0.227）×RA;
PC4值= 0.031×TQ+（ - 0.125）×FV/FM+0.219×CHL含量+（ - 0.220）×PN+0.130×WUE+0.431×EL+（-0.166）

排名值 = (52.67% × PC1) + (20.37% × PC2) + (8.25% × PC3) + (7.17% × PC4)。

根据PCA排序结果，将98个材料分为两个组分group-i和group-ii
其中第一组i为前一半，第二组ii为后一半。绿色字体标注的是抗性最强的5个材料，红色标注的是抗性最差的5个材料。

上面点图分析展示了PCA综合排序的结果，其中选择的极端材料如下所示：
为了解不同性状对多年生黑麦草耐热性的贡献，使用 Pearson 相关分析确定了 HSI 总体耐热性PCA 排名与每个生理/表型性状之间的关系。 PCA 排名与评价中使用的所有 8 个性状均显着相关（p ≤ 0.05），其中 PCA 和 EL 排名值的相关系数最大（r = − 0.858）。 Chl 含量、RWC 和 TQ 的排名值也与 PCA 的相关系数较高（分别为 r = 0.769、0.764 和 0.744）。 Pn 和 WUE 值与 PCA 的相关系数较低（分别为 r = 0.306 和 − 0.216）。

3). 叶绿素分解代谢基因的转录水平与多年生黑麦草耐热性相关

Pearson相关分析结果表明耐热性PCA排序值和Chl含量具有较大的相关系数（r = 0.769，表​表3），表明以Chl损失为特征的叶片衰老主要与多年生黑麦草的整体耐热性有关。

为了证实叶绿素分解代谢对多年生黑麦草耐热种质的贡献，我们进一步分析了4个叶绿素分解代谢基因（CCG，包括 LpNYC1、LpNOL、LpSGR 和 LpPPH）的转录与 98个黑麦草种质的耐热性。 如图所示，CCGs的相对表达水平在热敏感种质中显着高于耐热种质（5个抗性材料和5个感性材料）。

4). 基于SSR标记的98份多年生黑麦草种质分类

使用 66 对 SSR 分子标记估计所选黑麦草种质内的基因型多样性。 SSR 分析总共产生 864 个多态性条带，每对引物平均有 13 个和 3 到 26 个条带（补充材料 2）。 得到的多态性信息含量（PIC）值从 0.16 到 0.93 不等，平均为 0.70； 而基因多样性指数（Di）值在 0.16 到 0.94 之间，平均为 0.72（补充材料 2），证实所选种质代表了多年生黑麦草种质的多样化遗传库。 基于 SSR 结果构建 N-J 树状图，将 98 个黑麦草种质分为三组：簇 A、B 和 C，分别由 14、10 和 74 个黑麦草种质组成。

对每个系统发育簇中黑麦草种质的耐热性和生理性状的 PCA 排序值进行平均，结果表明簇 C 中的种质的平均 PCA 排序值（61.67）显着高于簇 A 和簇 A 和B（分别为 2.65 和 7.89），表明簇 A 和 B 中的材料的耐热性低于簇 C 中的材料。对于 Chl 含量、WUE、EL 和 RA 的耐热性基因型排序也观察到了类似的差异。

5). 耐热生理性状相关的SSR标记

使用 TASSEL 中的一般线性模型 (GLM) 进一步分析了 66 个 SSR 标记与七种生理特征之间的关联。如图 6 和表 5 所示，SSR 标记与 Chl 含量、Fv/Fm、Pn、WUE、EL 和 RA 在 R2 > 0.05 时的相对值之间共有 34 个关联（p < 0.01） .我们发现位于 4 号染色体上的两个标记 M144 和 rv0941 与叶绿素含量有关。

下面曼哈顿图显示的8个性状关联的结果，详细结果总结在文章中的table中：

4. 自我思考

（1）不足之处

1）文中仅为温室培养结果，并未进行田间实验验证工作，也与这个性状有关，热胁迫这一控制变量在田间很难达；
2）SSR标记密度过低，可以考虑使用其他分子标记，可能结果更详实；
3）4个明星基因存在表达差异，然而他们产生表达差异的原因或者调控因子并未解析，在多年生黑麦草中的调控机制如何，在耐热胁迫下是否存在变化需要分子实验证明；
4）挑选的材料一定程度上具有代表性，然而育种相关实践能够成功还未可知，可以增加相关的育种杂交实验，材料品质评估，培育更好的耐热性多年生黑麦草品种。

（2）可取之处

文章具有较好的完整性，故事逻辑性好，对我有很大的借鉴意义：
1）通过表型PCA分析排序，挖掘相关的性状，通过点图和PCA排序分类，PCA排序这个方法值得借鉴；
2）使用叶绿素明星基因对极端的10个材料进行表达验证；
3）使用SSR标记进化树分析和关联分析，进一步确认分类结果和挖掘性状关联标记，用于未来育种。

（3）继续研究

1）基于前期结果和开发的分子标记，筛选确认育种学相关研究，培育耐热性材料；
2）寻找叶绿素明星基因的上游调控元件和下游调控关系，尝试解析分子机理。

PCA计算的过程还是存在一些疑惑，这个得详细再看看。PCA值结果详细计算如下：
首先计算PCA贡献比率，确认占比85%以上的PCA个数为PC1到PC4；
然后将表型值得到的PCA结果，乘以对应的表型，每个材料得到对应的PC1到PC4结果；
最后对应的PC1到PC4结果乘以对应的贡献比率，就得到最终的PCA rank值。

参考文章链接：

https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12870-020-02695-8

https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12870-020-02695-8#additional-information