文献翻译-北京大学黄岩谊课题组在nature biotechnology的ECC测序方法文章

原文：http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3982

Highly accurate fluorogenic DNA sequencing with information theory-based error correction.

Zitian Chen, Wenxiong Zhou, Shuo Qiao, Li Kang, Haifeng Duan, X Sunney Xie & Yanyi Huang

翻译：文雨萌

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高精确度的荧光DNA测序，使用基于信息理论的纠错程序

 

摘要

限制“下一代DNA测序技术”的错误率是被证明有挑战性的。我们在此提供一种“纠错代码”测序法，此方法极大的极高了测序精确度，结合了边合成边荧光测序与一种基于信息理论的纠错算法。“纠错代码ECC”把测序读长（reads）中的冗余，通过“交替双碱基反应”嵌入了三条正交退化序列，此方法类似于编码+解码策略，在信息通讯和存储领域被有效的用来探测和纠正错误。我们展示了，当把“纠错代码ECC”与边合成边测序的荧光化学物质以原始准确率98.1%结合，ECC测序能支持单边、无错的序列长达200bp。ECC方法可以准确的识别非常稀有的基因组变异，应用于生物和制药的许多领域。

 

正文

上个十年，NGS下一代测序与Sanger测序发相比，开创性的降低了测序费用的四个数量级，极大的扩张了我们调查基础生物和制药领域问题的范围。许多测序试剂被研发和商业化。目前盛行的NGS测序法是边合成边测序，使用DNA聚合酶延长出一条新的DNA单链，通过检测寡核苷酸来推导模板序列的结构。

一项例外是PacificBiosciences的单分子测序技术，持续监测“原位链”的合成。所有其它边合成边测序法使用循环反应探测合成过程。这些方法进一步被流式反应物分为两大类。循环可逆终止CRT（如Illumina/Solexa，Direct/Helicos）和单核酸添加SNA（Roche/454，Ion Torrent）CRT方法使用终止核酸，在此核酸上3端羟基团被封闭，因此，当核算被结合到互补链上，互补链不会继续延长。在每一个循环中，四种核酸被不同的标签共价连接，被同时引入（反应体系），一个延长的碱基在每轮循环中被推测出来。相反，SNA方法每轮反应推测一种核酸，具有开放的3端羟基团。当被推测的核酸是互补的，序列就被延长，直到一个错配发生。

CRT和SNA法拥有不同的优势和劣势。CRT使用荧光，它很稳定并高效的为核酸结合发出信号，尽管信号的强度是这方法的优势，复杂性和反应试剂的不完美，比如裂解荧光标记后新生链上留下的伤痕，会引起测序错误和读长限制。SNA法的主要内在优势是每个结合反应的产物都是自然的DNA，没有终止基团或者裂解标签产生的伤痕。提供了产生更长读长的可能性。然而，目前SNA法仪器（Roche454和Ion Torrent的hydrogen ions）中可被探测的信号都转瞬即逝，并且信号强度和一次循环中结合上的同聚物dNTPs数量的线性关系十分差。在我们之前的报告中，我们展示了荧光SNA法，它也产生自然DNA，但是释放稳定的荧光分子，对延长的核酸数量按照比率度量来推测，降低了同聚物测序的难度。

这次我们发布一种DNA策略，ECC测序，极大的提高测序准确率和读长，使用双碱基流式，结合荧光SBS试剂。ECC测序法允许两个类型的底物混合被引入每个循环。合成的链暴露了可结合的3端羟基团，可以持续的延长，直到混合物中没有核酸可以结合。尽管每个上述反应仅仅提供一个简并序列，其上定义了部分的碱基组成，一条DNA模板链可以被测序三次，使用双碱基混合的正交组合，提供三条简并序列，因而含糊的序列可以被准确的推测出来。任何简并序列的测序错误可以被进一步识别，并纠错。ECC测序不需要比SNA更多的反应时间，但是用正交流式的额外信息提供更高的测序准确度。理论上，EXX测序策略可以被应用于任何SNA测序试剂。我们建立了实验室的测序原型机，来展示完整的ECC流程，使用荧光SBS试剂，得到单边读长，长达250bp，前200个bp无错