病理验证mIF和TMA路线（自学）

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技术

使用配对病理切片 mIF验证

单基因使用TMA验证

技术

多重荧光免疫组化技术 (Multiplex immunohistochemical，mIHC) 也称作酪氨酸信号放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技术，是一类利用辣根过氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该方法基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术，允许同时检测单个细胞或组织样本上的多个目标靶点，全面研究细胞组成、细胞功能和细胞间相互作用。干货分享 | 多重荧光免疫组化技术 (mIHC) - 知乎 (zhihu.com)

组织芯片(tissue chip)又称组织微阵列(tissue microarray,TMA),是以形态学为基础的分子生物学新技术，将数十至上千个小组织标本以规则阵列方式整齐排布于同一载体上而制成的组织切片，它是继基因芯片、蛋白质芯片之后出现的又一种重要的生物芯片，主要用于研究同一种基因或蛋白质分子在不同细胞或组织中表达的情况，具有高通量、大样本、省时快速等优点。

组织芯片技术 - 知乎 (zhihu.com)

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使用配对病理切片 mIF验证

采用与转录配对的病理切片，利用转录组进行评分分组，然后病理切片上验证相关模型的免疫浸润情况。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35557959/

作者用16个基因构建FAMscore。在 TCGA 和 AHJU 中，高 FAMscore 是 GC 患者 OS 不良的独立预测因子。使用mIF进行验证。

mIF：抗CD8（CST70306，Cell Signaling Technology，美国）、抗 CD56 （CST3576）、抗 panCK （CST4545）、抗 S100 （ab52642，Abcam，英国）、抗 HLA-DR （ab92511） 和抗 CD68 （BX50031，Biolynx，China） 使用PANO 7-plex IHC 试剂盒（Panovue，Beijing，China），根据制造商的说明。Mantra 系统（PerkinElmer， Waltham， MA， United States）用于扫描染色的载玻片并重建切片的图像。inForm图像分析软件（PerkinElmer，Waltham，MA，United States）用于定量图像中的细胞。

FAMscore和免疫浸润。（A）浸润到肿瘤中的免疫细胞表面生物标志物的mIF染色。1：CD8染色;2：CD56染色;3：HLA-DR（红色）和CD68（绿色）染色;4：重建图像，包括所有生物标志物。（B） AHJU 队列肿瘤实质中浸润免疫细胞的密度，按 FAMscore 水平分层。（C） 由 xCell 基于转录组计算的胃癌组织中 TCGA 浸润免疫细胞的丰度，按 FAMscore 水平分层。mIF：多重免疫荧光;AHJU：江苏大学附属医院;TCGA：癌症基因组图谱。

文献：A Genomic Signature Reflecting Fibroblast Infiltration Into Gastric Cancer Is Associated With Prognosis and Treatment Outcomes of Immune Checkpoint Inhibitors

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单基因使用TMA验证

Spatial and single-cell analyses uncover links between ALKBH1 and tumor-associated macrophages in gastric cancer | Cancer Cell International | Full Text (biomedcentral.com)

 为了验证 ALKBH1 与 STAD 中巨噬细胞之间的关系，我们对 TMA 中整个 STAD 进行了 ALKBH1、CD163 和 DAPI 的三重标记免疫荧光研究。将STAD TMA样品分为早期和晚期，采用全景组织扫描分析其荧光强度。

研究 STAD 进展期间肿瘤活检中 ALKBH1 和 CD163 表达之间的相关性。用 ALKBH1、CD163 和 DAPI 的免疫荧光对整个 TMA 进行三重标记，然后进行全景组织扫描。B 采用Pearson相关系数显示ALKBH1和CD163荧光信号的重叠值。C 使用散点图来说明每个患者读数的 ALKBH1 和 CD163 之间的归一化 Spearman 相关性。D CIBERSORT数据集中STAD中ALKBH1和CD163表达之间的相关性以散点图的形式显示。** p < 0.01

肾癌中相同实验路线：

Single-cell landscape and spatial transcriptomic analysis reveals macrophage infiltration and glycolytic metabolism in kidney renal clear cell carcinoma - PMC (nih.gov)

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Spatial and single-cell explorations uncover prognostic significance and immunological functions of mitochondrial calcium uniporter in breast cancer - PubMed (nih.gov)

为了确定 BRCA 中 MCU 和 T 细胞之间的相关性，我们在 TMA 样品的整个 BRCA 切片中进行了四重免疫荧光标记，包括 DAPI、MCU、FOXP3 和 TGFb1。将这些样本分为非肿瘤组、早期组和晚期组，并使用全景组织扫描评估其荧光强度。

研究 MCU 与 BRCA 免疫浸润之间的关联。A 评估 MCU 水平与 T 细胞 CD8 + 之间的关系。B–C 研究 MCU 与 T 细胞 CD8 + 相关基因之间的相关性。D 研究乳腺癌活检中 MCU 和 T 细胞生物标志物之间的关联。使用 DAPI、MCU、FOXP3 和 TGFb1 在组织微阵列 （TMA） 上利用全面的免疫荧光标记，然后进行全景组织扫描。采用Pearson相关系数描述MCU与FOXP3 E以及TGFb1 F荧光信号之间的共定位程度。**P < 0.01， ***P < 0.001