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2015年，一款开创性的单细胞分析工具Seurat首次亮相，从这以后单细胞分析得到了广泛普及，不久前Seurat重磅推出了V5版本。今天给大家分享Seurat V5的标准分析流程。函数，可以实现一行代码去批次，当前支持以下几种主流的单细胞去批次，其中包含了我们上面用到的harmony。注意去批次前可能需要分层。用Seurat V5中新增的。

前面有数据的整理和创建Seurat V4数据整理，数据的获取方式一致。

单细胞转录组测序分析步骤：用 CellRanger 识别细胞后构建 Seurat 矩阵，根据之前的研究过滤低质量细胞，最后获得数据进行聚类分析。首先，选取方差最大的前 2000 个基因进行数据归一化，使用主成分分析（PCA）将数据维度降低到 50 个主成分，并使用harmony去除样本的批次效应。通过 tSNE 聚类分析，共确定了 9 个聚类（B 细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、NK 细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞、骨髓细胞和浆细胞）。然后，提取每个细胞群的基因表达矩阵，以确定亚群。

方法使用单细胞 RNA 测序评估了来自 6 名患者的 10 份新鲜人体组织样本，包括原发性肿瘤和邻近的非肿瘤样本以及来自不同器官或组织（肝脏、腹膜、卵巢、淋巴结）的 6 个转移灶。使用组织学测定和大量转录组数据集进行验证实验。结果发现与侵袭特征、腹膜内转移倾向、上皮-间充质转化诱导的肿瘤干细胞表型或休眠样特征相关的恶性上皮亚簇。在包含 407 个样本的 GC 队列中，前三个亚簇相关基因的高表达比低表达基因的总生存率更差。免疫细胞和基质细胞表现出细胞异质性，并创造了促肿瘤和免疫抑制微环境。

下载表达矩阵和细胞注释信息。

分析配对的单细胞及转录组胃癌数据的 HDS评分，数据源于评分基因为单因素Cox回归分析中，HR为1的基因被定义为基因集B。A和B基因集用于后续分析。采用PCA构建HDS，其中主成分1被选为特征评分。