第一代基因测序信号处理技术

第一代基因测序信号处理技术

按信号处理流程，完整的阐述碱基信号的处理方法，并在实践中进行了应用，仅供大家参考。

测序仪输出信号特点和问题

1.四个通道输出四种碱基的峰形曲线；
2.每个碱基峰形的出峰时间(峰位)表示了DNA片段的长度；（参考Sanger测序原理）
3.不同通道碱基峰之间的间距是变化的，可能出现重叠、错位，取决于仪器性能好坏；
4.同一个通道碱基峰之间存在峰形重叠
5.受噪声信号干扰，小信号碱基峰信噪比较差；

信号预处理

有效信号提取

测序仪输出原始信号起始段是无效信号，此时DNA片段尚未到达检测窗口；尾部也同样存在无效信号。因此，首先需要提取图中黑色虚框中的有效信号。可以根据信号强度在此位置的突变进行判定，此类方法较多，可以选择合适算法自适应提取此段有效信号。

基线扣除

这一步有时候并不需要，主要看测序仪端输出信号的质量。基线漂移扣除方法有：线性基线扣除法、滑动窗口极小值法、小波系数重构等。

信号平滑

信号平滑是根据曲线峰形特点选取合适的滤波系数进行平滑处理，由于碱基峰形近似高斯峰。因此可以采用高斯滤波，根据碱基峰宽选择滤波系数。也可以采用小波滤波、SG滤波以及其他低通滤波算法，不管选择那种方法，其目标是提高平滑度，但不能造成峰形失真。

峰形处理技术

封顶补偿

封顶主要是AD采样芯片选择不合理造成，因此在信号浓度正常范围条件下，是不会出现封顶现象的。因此在测序仪各项指标调节合理的情况下，这个步骤可以省去。
封顶补偿方法可以采用高斯峰拟合逼近来重构封顶削去部分的峰形。但是补偿对峰高的准确性一定程度上会丢失，幸好碱基峰识别时，峰高小范围的误差影响较小。

峰形分离度增强

峰形分离是碱基峰识别关键一步，上图原始碱基峰曲线峰形重叠严重，很难区分峰形个数以及峰位值，下图是经过峰形分离度增强处理后的峰形曲线（图中峰位也进行了重新排序）。一般可以通过峰宽初步判定碱基峰个数，再通过多个高斯峰拟合重构碱基峰。

碱基峰搜索及自适应判定阈值提取

在碱基峰搜索时，首先需要确定碱基峰高的判定阈值。从目前测序的波形看往往起始碱基峰高比较大（这个跟试剂和仪器性能有关，不具有普遍性）。因此，在不同峰位区间峰高的判定阈值必然是不同的，需要得到随峰高浮动的趋势线。由于碱基峰高具有一定的随机性，这个与ddNTP是随机结合的特点有关。因此，实际阈值需要在趋势线的基础上乘上一定的系数来得到，该系数值可以通过峰高分布的95%置信区间来确定。

碱基序列识别技术

碱基峰位漂移修正

AGCT在DNA上的排列顺序可以视为等间距排列，但在四个通道上，碱基峰的出峰时间顺序上可能存在间距变大、变小、两个碱基重叠出现、两个碱基错位出现等现象。虽然不影响碱基类型识别，但会影响碱基序列识别。

碱基峰位漂移修正的目标是保证碱基峰位尽可能等间距分布，因此，在峰位优化时，将AGCT峰位差作为优化输入序列，优化目标为峰位差的方差最小化。输入变量和目标函数都有了，就差优化算法了，大家可以参考相关文献，或者自己建模，我就到此为止了。

碱基序列增删处理

由于前面碱基峰搜索中难免会遗漏个别小碱基峰或者引入干扰峰，因此，最后还需要进一步过滤，将漏的、假的重新筛查一遍，尽可能补充完整。
在假峰剔除处理中，主要依赖峰形质量系数进行判定此峰可能为假峰，然后在假峰区间范围内进一步验证。
在漏峰增加处理中，主要利用峰位差进行判定，如果峰位差和周围几个相差太多，则认为可能有漏峰存在，然后在此区间内容进一步搜索验证。