超全荧光定量PCR应用常见问题

实时荧光定量技术是什么

 

20世界90年代由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术（Real-time qPCR），其基本原理是在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光染料探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。荧光定量PCR最大的优势可以对初始模板进行定量，目前已广泛应用于生命科学、医学研究等领域。

 

小编总结荧光定量PCR常见问题打包给各位 ，现整理如下，请大家批评指正。

 

常见问题罗列

没有CT值

实验结果一旦遇到没有Ct值情况，就要在第一时间排查是否有以下问题：

 

（1）循环数不够（但是一般不超过45循环，不仅背景值提高，定量也不准）；

 

（2）PCR程序设置不对，检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中；

 

（3）引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解；

 

（4）模板量可能降解或上样量不足（但一般不超过500ng，根据试剂盒说明书即可），对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；如果发生模板降解，应考虑样品准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样品小量分装储备，避免反复冻融；

 

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