大家对前几期《做成像的你不得不了解的真相》系列文章反馈积极,小编倍受鼓舞,今天再来开讲新话题——信噪比。
做荧光成像的你一定有这个经历吧,你小心翼翼制备好了样品,调整好显微镜和软件,点击拍照按钮,结果得到了下面的图像。
![图片](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/c73837e4ad48263029c0168de7c76952.jpeg)
看到这样的图像是不是有点沮丧?不过,有经验的用户已经意识到问题所在,并且手动把曝光时间延长,或是提高激发光强度,这时你看到的图像可能就是下面两张了。
![图片](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/25d510ef83c98d04fe3af03d23323e3f.jpeg)
![图片](https://img-blog.csdnimg.cn/img_convert/ace449f4d18680fd9eb8b52167ccb9de.jpeg)
哇,图像质量提升立竿见影啊!是的,你对这三张图像质量的观感,就是今天小编想唠一唠的问题——成像质量最重要的判断依据——信噪比。
在展开这个问题之前,请大家思考以下两个问题:
1. 图一和图三的噪声相比,哪一个更大?
2. 信噪比到底是什么呢?
专业问题答案分割线 —— 先想一想再看答案哦!
好了,我们来公布答案咯!大家看看自己想的对不对。
正确答案:
1. 图三噪声大,图一小。我的原力告诉我,很多人都答错了!
2. 信噪比就是信号和噪声之比值。呵呵,这个回答没毛病,不过仅仅是字面上的解释,还是比较抽象。为了把这个概念讲清楚,还是不得不上公式:
看上去好多新概念,不过并不难理解。下面我们一个个来解释一下:
先来说信号。信号实际上就是我们实验中GFP绿色的荧光,或者RFP红色的荧光。而光子数就是荧光强度的定量表述。数字成像设备,需要将光信号转换为可以测量的电信号,例如共聚焦显微镜里的光电倍增管(PMT),或是宽场荧光成像使用的相机(CCD,CMOS相机)。而量子效率(Quantum Efficiency, QE)就是PMT或者相机将光信号转换为电信号的效率。检测设备最重要的一个性能,就是要有更高的量子效率。
然后我们说噪声。噪声源实际上也有很多种,大家都知道相机自身是会产生噪声的,而对于和活细胞弱荧光成像相似的应用,相机的读出噪声(Readout Noise)是对图像质量影响很大的一个参数。除了读出噪声,相机实际上还有其它很多种噪声,例如暗噪声(Dark Noise),或是对CMOS相机成像质量影响较大的相关性噪声(Correlated Noise)。除某些特定成像应用外,一般暗噪声或是相关性噪声的贡献很小,在这篇文章中小编就不过多讨论。忽略掉其它的噪声源,上面的公式可以简化成为
这里还有一个非常重要的噪声源,称为散粒噪声(Shot Noise),由于从相机硬件层面无法降低散粒噪声,所以很多时候这个最为重要的噪声反而并没有太多人提及。(注:硬件层面没办法,并不意味着软件层面没办法哦!)
散粒噪声是光信号自身的噪声
上面的公式就进一步变化为
这个时候,我们分析信噪比随信号变化的曲线,会得到如下结果。其中实线表示无噪声的理想相机,虚线是实际的相机。可见,读出噪声越大,相机曲线与理想曲线偏离越远。
从以上公式可以看出,在信号比较强的情况下,散粒噪声远远大于读出噪声,信噪比其实等于
这时,决定信噪比的仅仅是信号强度和量子效率!本文开始时提到的,通过增加曝光时间或是加强激发光,能提高图像的原因就在这里了。不过,实际拍照时,由于各种原因,例如避免光漂白、光毒性,或是为了提高速度,活细胞成像的信号常常处在相对较低的水平,这时候我们就需要借助信噪比来判断图像质量好坏与否了。
用上面这张图为范例,信噪比的计算方法如下,
除了判断图像质量,对于很多需要做荧光定量测量的应用,例如简单的钙离子成像,FRET/FRAP,或是复杂如单分子定位的超高分辨率成像(STORM/PALM),这也是一个非常重要的概念。
最后我们回到开始的问题,为什么图3的噪声会高过图1呢?原因很简单,图3本身信号强,散粒噪声占主导地位,噪声远大于图1。图3质量好,并不是噪声小,而是信噪比高。
以上,我们讨论了信噪比的一些基本概念。现在给大家再出两个问题,请判断以下说法是否正确:
-
成像的追求,就是要不断提高信噪比;没有最好,只有更好
-
图像的信噪比,有经验后视觉判断就可以了, 定量计算很难,也没有必要
期待大家踊跃留言回答,小编将会在下一篇文章中给出解答。