关于差异表达分析的基本步骤和知识点

1. 什么是10x数据？

（1）Gel bead与细胞结合，形成GEMs。

在这个过程中，与细胞结合并标记细胞的Gel bead由四个部分组成。各有其各自的作用。

R1：为一段已知序列的DNA片段，用于后续的测序。（DNA序列）
10X Barcode：用于标记细胞。（细胞名称）
UMI：在混合测序的过程中，用于区分不同的cDNA来源的reads。也就是在后续的建库扩增的过程中，cDNA不断的扩增产生reads,来源于同一个转录本的reads的UMI相同。（cDNA来源，不同mRNA，不同细胞，UMI不同）
poly(dT)VN：通过与mRNA的polyA尾互补配对，捕获细胞中游离的mRNA。
每一个细胞有一个特征的UMI。之后，在进行扩增建库的过程中，只要是由该细胞扩增产生的cDNA,都会带有这段UMI。

（2）建库
通过某种方法，将细胞裂解，释放出mRNA,利用逆转录酶，将mRNA反转成双链cDNA,进行扩增。而Gel bead所起到的作用就是，将我们细胞中的mRNA的序列信息捕获，然后通过反转录的方式，转换为带有特征的细胞标记的reads。
由于这个平台的测序过程是高通量的。所以，将所有的reads（来源于不同的细胞的不同的mRNA）都集中起来进行测序。而后续的过程中，如何将这些不同来源的reads区分开来，就是利用我们的标记。
一般而言，有几个维度的标记：

来自哪一个样本（患者，如果是一个个体的某个组织的话，另当别论）
来自哪一个细胞（因为我们要在细胞维度上，进行表达量的识别，所以这部分的信息也很重要）
——10X barcode
来自哪一个基因（通过基因的识别，我们知道是哪些基因的表达）
——UMI
所以，最终表现在counts矩阵上，就是行为所在的细胞，列为基因，值为定量后的表达值。

（3）生物信息学分析
一般而言，会使用Cell Ranger，以及随后使用的seurat包进行数据的处理。

参考链接：https://www.jianshu.com/p/ef88433709bd

特征：
（1）非全长的测序，通过测序3’端，来定量基因的表达。具有较强的3’端偏好性。
（2）测序样本，要求90%以上活细胞。
（3）真正意义上对单个细胞的表达量进行汇总。
（4）通量高，建库周期短。10X Genomics 一次测序可以捕捉100-80,000个细胞，具有极高的细胞通量。单细胞的测序通量平均也在50,000 reads/每一个细胞，而如果使用细胞核进行测序则平均通量为25,000 reads/每一个细胞核。
（5）具有较为严重的drop out问题。
什么是drop out问题？这个问题是单细胞测序技术的普遍的问题，只不过10X的方法得到的结果更为显著。具体表现在，一些基因在一些细胞中根本检测不出表达，在另外一些细胞中则显著高表达（排除生物学因素影响）。

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2. 什么是cell ranger？

Cell Ranger is a set of analysis pipelines that process Chromium single-cell data to align reads, generate feature-barcode matrices, perform clustering and other secondary analysis, and more. 

Cell Ranger是一组分析管道，处理铬单细胞数据以对齐读取、生成特征条形码矩阵、执行聚类和其他二次分析等。

5种方法

        1.cellranger mkfastq

        2.cellranger count

        3.​​​​​​Cellranger aggr

        4.cellranger reanalyze

        5.cellranger multi

工作流程

        如果从BCL文件开始，生成流细胞目录，建议使用cellranger mkfastq生成FASTQs；

        如果从已经被bcl2fastq解编的FASTQs文件开始，可以直接从 cellranger count开始。

        

      一个样本在GEM well中处理在flowcell上排列好，在这种情况下，用 cellranger mkfastq生成FASTQ文件，用cellranger count在单样本分析（ Single-Sample Analysis）中进行描述。

3. 怎么设置Seurat对象

1. Read10x() 函数读取数据——>返回UMI计数矩阵。

2. 创建Seurat对象。其中包含单细胞数据集的数据（如计数矩阵）和分析（如PCR或聚类结果）。

 4. QC指标是什么？

        quality control 质量控制

        常用的一些 QC 指标包括：

                在每个细胞中检测到的独特基因的数量。