人类蛋白质组芯片助力药物靶点筛选

As2O3这一古老的中药在急性早幼粒细胞白血病（APL）治疗中的作用明确，并且对其它恶性肿瘤也具有显著治疗效果。As2O3直接作用靶点的鉴定是揭开其作用机理的最关键一环，然而该科学问题一直困绕着药学研究领域的专家学者们，本次解读分享，华盈生物合作伙伴上海交通大学陶生策教授课题组研究人员，应用高通量的人类蛋白质组芯片技术找到了360个特异性的砒霜（As2O3）结合蛋白。该研究揭示了As2O3通过抑制糖酵解途径的限速酶己糖激酶2（HK2），抑制细胞代谢引发肿瘤细胞凋亡的作用机制。此外，这项工作中鉴定的As2O3结合蛋白有望成为开发协同抗肿瘤治疗策略的宝贵资源。该研究成果被美国科学院院报（PNAS）收录（PMID:26598702），同时被评为小分子药物靶点研究的经典范文。

一、As2O3靶标蛋白筛选

为了鉴定As2O3的结合蛋白，研究人员采用了HuProt™20K人类蛋白组芯片（覆盖2万种人类全长蛋白），该技术是将As2O3生物素化后与芯片一起孵育，来检测化合物的结合蛋白（图1A）。因此，研究人员设置了实验组（As2O3-Biotin）和对照组（Biotin），为了确保结合的特异性，研究人员还设置了竞争组。图1B是随机选择的实验组和对照组芯片上的相同区域，显示实验组有更多的阳性信号。研究人员通过人类蛋白组芯片共鉴定出360种与As2O3直接结合的蛋白。图1C展示了其中部分结合蛋白，其中PML是已知的As2O3结合蛋白。

图1.As2O3靶标蛋白筛选

二、As2O3靶向糖酵解通路

针对人类蛋白组芯片筛选出的360个结合蛋白，通过DAVID数据库进行KEGG pathway分析，糖酵解通路倍显著富集（图2A），且PPI网络中最紧密连接的簇（Cluster 1）是由参与糖酵解途径或与糖酵解途径高度相关的许多酶组成（图2B-C）。

图2.As2O3靶向糖酵解通路

三、As2O3与靶点蛋白HK2结合并抑制其体外活性

鉴于As2O3结合蛋白的多数被鉴定为糖酵解酶，研究人员对As2O3结合及其对糖酵解的关键酶的功能性结果进行了更详细的体外表征。其中糖酵解酶HK1是As2O3的结合蛋白，因此研究人员对其高度同源的HK2进行研究。尽管HK2不在人类蛋白质组芯片上，但已知该蛋白在快速生长的肿瘤中维持高葡萄糖分解代谢率方面起关键作用，并且与HK1高度同源。因此，研究人员推断As2O3也可能与HK2结合。WB实验表明，As2O3能与HK2及其他糖酵解酶结合，并且加入As2O3解毒剂BAL后，结合作用显著降低（图3A）。研究人员利用生物膜层干涉技术（BLI）测定PML和HK2对As2O3的结合亲和力，发现HK2和As2O3 亲和力比PML和As2O3 更强。（图3B）。

接着，研究人员测定了As2O3结合HK2后对HK2活性的影响，发现2μM As2O3在体外急剧抑制HK2的活性，显著降低葡萄糖-6-磷酸（G6P）反应产物（图3D）。

图3.As2O3与HK2结合并抑制其体外活性（D改为C）

四、HK2过表达逆转As2O3诱导的细胞凋亡

已有研究表明，As2O3处理癌细胞时会导致显著的生长抑制和凋亡。因此，研究人员猜测As2O3对癌细胞的这些有害作用的可能机制之一是通过As2O3对HK2的抑制性结合来介导的。为了验证这一假设，研究人员在胃癌细胞系SGC7901细胞中过表达HK2（图4A-B），用As2O3处理这些细胞，并通过流式细胞术监测细胞凋亡。结果显示，用As2O3处理细胞12小时后，在对照细胞中显著诱导细胞凋亡（18.1％），但在HK2过表达的细胞中凋亡率降至1.32％（图4C-D）。

图4.HK2过表达逆转As2O3诱导的细胞凋亡

五、HK2是体内As2O3的靶标

因为As2O3与直接参与糖酵解通路的大部分酶结合并抑制HK2的活性，研究人员假设As2O3处理的癌细胞中该通路的许多代谢物将发生显著变化。为了测试这种可能性，在胃癌细胞系SGC7901中进行了这些代谢物变化的系统分析。糖酵解的第一步和限速步骤由己糖激酶（癌细胞中的HK2）催化（图5A）。代谢组学分析显示，用As2O3处理12h的细胞中己糖激酶的直接产物G6P浓度低于对照细胞，甚至在24h更低（图5B）。此外，用As2O3处理24h的细胞中乳酸的浓度（糖酵解程度的指数）也低于对照细胞（图5C）。为了排除As2O3处理后改变了细胞中葡萄糖的浓度，而导致较低浓度的G6P和乳酸的可能性，对SGC7901细胞中葡萄糖的浓度进行研究，发现在所有时间点，As2O3处理细胞中葡萄糖的浓度与对照细胞没有显著差异（图4D）。这些结果表明As2O3显著抑制糖酵解，并表明抑制己糖激酶活性是细胞内这种作用的主要因素。

图5.HK2是体内As2O3的靶标

六、结论与总结

在本研究中，利用人类蛋白组芯片技术找到As2O3的药物靶点，其直接结合蛋白对于揭开As2O3抗癌机制的大幕十分关键。在近30年的研究中，研究人员采用传统方法找到的As2O3直接作用靶点不超过20个，大部分研究都是从转录组和蛋白表达调控水平去间接解释As2O3的作用机理。陶生策教授的研究成果不仅让学界对于As2O3的作用机理有了更新的认识。同时，该研究的技术路线为小分子药物靶点的筛选和机制研究提供了新的技术示范。即通过蛋白质组芯片技术快速寻找经典小分子药物的直接作用蛋白，阐明药物调控机理。

除了直接作用靶点的筛选及验证，达吉特针对于中药及小分子药物研究，还建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分分离与鉴定；

2）小分子化合物生物素标记

3)  小分子靶点筛选：芯片+质谱

4）药物调控信号通路磷酸化筛选

5）网络药理学与分子对接

6）SPR表面等离子共振（分子动力学）

如果广大研究人员手上也有被证实临床药效的小分子单体或中药复方，达吉特可通过专业的技术服务助您完成一篇高质量的药物靶点-机理研究论文。