质谱流式细胞技术（CyTOF）常见FAQ

问：CyTOF的检测速度是多少？一管细胞需要检测多久？

答：CyTOF的检测速度一般为500细胞/秒，如果检测量为30万个细胞的话，时间大约在10分钟左右，每个样本检测量不同，根据检测量检测的时间会有上下浮动。

问：CyTOF的样本要求？我的样本能做CyTOF吗

答：目前CyTOF检测的样本主要为人源样本和小鼠源样本，检测类型包含外周血、骨髓、组织、细胞系、干细胞等多种样本，CyTOF样本的细胞量最好在4×106左右，且细胞活率应大于70%。

问：CyTOF这项技术成熟吗？和单细胞测序比怎么样？

答：CyTOF这项技术的相关文献已发表2100多篇，其中30%发表在《nature》、《Science》、《Cell》及其子刊上，是在蛋白质层面研究单细胞的首选。单细胞测序作为一项同样应用广泛的单细胞研究技术，其检测通量（1万细胞）低于CyTOF（100万细胞），同时单细胞测序检测的是RNA层面，而CyTOF检测的是蛋白层面。

问：CyTOF在送样时有什么要求吗？

答：除了要满足细胞数量（4×106）和活率（70%）的要求外，寄送的样本类型也有一定要求。即便是使用低温和保存液保存，长时间的寄送也会导致组织和外周样本有一定的损伤，因此为了样本的最佳状态，推荐远距离寄送前自主制备成单细胞悬液，然后梯度冻存后再干冰寄送。

问：CyTOF每个组做几例比较合适？

答：目前在文献中报道的小鼠源样本，一般每组至少5例以上才能保证具有统计意义。人源样本的个体差异较大，需要根据实验方案再设计，在疾病特征研究或者预后标志物的发现中，样本量是在能力范围内越多越好。

问：CyTOF的抗体如何选择？

答：华盈生物目前设计了两款CyTOF的抗体Panel，分别是针对人样本的30 marker Panel和小鼠样本的33 marker Panel，这两个抗体组合可以覆盖研究中常见的免疫细胞。同时也提供了10个左右的定制通道，可以根据研究目的进行选择。同时可以进行抗体定制，在Panel中加入个性化的抗体。

问：CyTOF的项目周期一般为多久？

答：CyTOF项目周期主要根据样本数量、抗体货期、抗体是否需要定制来决定，如果仅使用固定Panel对20例以内的样本进行分析，周期一般在6-8周左右。

问：CyTOF定制的抗体有什么要求吗？如何选择合适的抗体？

答：CyTOF抗体定制即在一抗末端偶联金属标签，一抗在知名抗体厂商如：Abcam、CST、Thermo Fisher、Biolegend等多个品牌中均有售卖。最适选择是抗体的应用中包含：CyTOF，如果应用中没有CyTOF可以选择含有Flow Cytometry的抗体。抗体偶联的周期较长，实验风险也相对较大。

问：CyTOF的数据结果是什么样的？如何对这些数据结果进行分析呢？

答：CyTOF数据结果为FCS格式文件，其中包含每一个细胞的所有marker的表达量，目前主流的平台Cytobank和Flowjo均可以对CyTOF的结果进行处理和分析，同时一些高级分析在R上也可以实现，目前已有大量的CyTOF包在R上得到了广泛的应用。华盈生物在项目中会提供CyTOF基础分析，帮助您发现更多细胞中的差异。

问：CyTOF实验的单细胞悬液如何制备？有什么要求吗？

答：CyTOF检测的样本最终状态为单细胞悬液，制备的方法与流式细胞术单细胞悬液制备方法基本一致，但是因为CyTOF最终检测的是金属离子，因此在制备过程中需要避免使用含有金属离子的试剂和仪器，例如含有Ca2+、Mg2+的PBS溶液。

问：CyTOF的预实验需要做什么准备吗？

答：如果实验涉及的抗体仅包含膜蛋白，在预实验过程中仅需要测试一下抗体的最佳浓度，如果包含胞内蛋白则需要测试一下膜蛋白和胞内蛋白的染色顺序。因此客户在提供样本时需要额外提供预实验的样本。

问：CyTOF可以对胞内蛋白进行检测吗？

答：CyTOF不仅可以对细胞的膜蛋白进行检测还可以同步对胞内蛋白和核蛋白进行检测，同步实现对细胞、细胞因子和细胞功能状态的研究。

问：CyTOF如何实现超多抗体的同步检测的？

答：CyTOF的抗体尾部连接了金属及其同位素的标签，每一个原子量就是一个通道，这种标签系统代替了传统的荧光标签系统，不会出现谱带重叠，同时开发的通道也非常多，可以实现30-50种蛋白的同步检测，同时最终检测系统为ICP-MS系统，可以对金属标签进行高精度的检测，最终两个系统结合实现超多抗体的同步检测。

问：CyTOF检测后能给我们提供什么结果？

答：在我们的样本中免疫细胞的数量和种类都十分庞大，CyTOF可以对样本中的几十种免疫细胞的含量进行检测，从而发现在治疗或者疾病发生过程中出现变化的免疫细胞，同时还可以针对这些免疫细胞的细胞因子进行分析。相关性分析还能帮助我们找到有关联的细胞亚型，发现组织中的细胞关系。

问：CyTOF只能用于肿瘤研究吗？其他的领域可以做这项技术吗？

答：目前CyTOF的应用领域非常广泛，如血液、心血管、衰老、肿瘤、神经、自身免疫等多个研究方向，因此这项技术不仅仅可以对肿瘤进行研究，还可以在其他的研究方向发光发热。同时这项技术不仅可以在基础研究中帮助我们发现关键细胞机制，还可以结合临床数据发现疾病预后标志细胞和疾病靶点。

问：已经进行过单细胞测序检测了，还有必要做CyTOF吗？

答：目前已经发表的文章中，有一部分研究人员会在单细胞测序后再使用CyTOF对之前的数据进行验证，蛋白验证核酸在我们的日常科研中也是很常见的。同时因为单细胞测序检测细胞量较少，难免会遗漏一些含量少的细胞，而这些含量少的细胞可能恰恰是疾病中的关键细胞，因此质谱流式可以帮助我们发现这样稀少的细胞亚型。

问：CyTOF发现差异细胞后如何进行下一步的研究呢？

答：在我们使用CyTOF发现差异细胞之后我们可以针对这种细胞的功能进行研究，或者对细胞中的细胞因子进行研究；同时质谱流式可以研究细胞的状态，可以从状态方面入手发现细胞在疾病发展或治疗过程中状态的改变；也可以对细胞进行分选后再培养，验证这种细胞对疾病或治疗的影响；也可以使用空间组学去探究这个细胞的空间关系，以及与之相邻的细胞。CyTOF的结果可以为我们带来丰富的细胞信息，帮助我们在庞大的细胞海洋中找到那一个关键的细胞。