包括牙周炎在内的牙周疾病影响全球数十亿人，以牙龈发炎和牙周支持组织的破坏为特征，且牙周病与超过60种系统性疾病有关。然而，医学界对于牙周病的认识仍然有限，这限制了精准医疗方法的发展。这主要体现在对于牙周组织复杂的细胞群体和细胞状态的理解有限，尤其是功能性的牙龈上皮的细胞诠释，以及周围的组织微环境特征，和口腔微生物的互作关系等仍然不清楚。
近期来自美国NIH、ADA和多家机构的研究团队在《Nature Communications》杂志发表了一项题为“Single-cell and spatially resolved interactomics of tooth-associated keratinocytes in periodontitis“的研究成果。该研究整合分析了牙龈上皮组织的scRNA-seq公共数据库，发现了沟内上皮和结合上皮具有的免疫作用，通过RNAscope证实了某些牙周病原菌出现在了牙龈上皮中。重要的，研究者利用Phenocycler-Fusion(PCF)空间单细胞蛋白组技术在组织原位全面解析了牙周炎中牙龈上皮周围的免疫微环境特征，进一步证实了“结构性免疫”在牙周炎中的重要作用。研究揭示了沟内上皮和结合上皮在牙周炎病程中的不同的微环境生态位，为未来牙周炎的精准治疗提供了新的研究方向和理论基础。
01 牙龈上皮组织的全新注释
牙齿由多种细胞类型支持，这些细胞对牙齿健康至关重要，但它们在牙齿疾病中的具体作用尚未充分研究。作者分析了4个scRNA-seq数据集（20个健康、4个牙龈炎和10个牙周炎），通过对数据集的整合对32种不同的细胞类型进行了统一的注释，包括上皮细胞、基质细胞、内皮细胞、神经细胞和免疫细胞等。特别关注了牙龈上皮的异质性，包括非角化牙槽粘膜（AM）、附着牙龈(AG)、牙龈边缘（GM）以及角质化的沟内上皮和结合上皮（SK/JK），并发现了这些区域的细胞表达特定的标记基因（图1）。并且还进一步诠释了上皮组织的基底层细胞（干细胞）和分化的后代上基底层细胞的在不同区域中的特征性marker，以及上皮细胞更加细分的亚群类型。所有角质化的细胞普遍表达KRT5/KRT14，而SK/JKs还表达更高水平的FDCSP、ODAM以及特定的角蛋白（KRT7和KRT19）。
图1 重新注释牙龈上皮组织的细胞类型
02 牙龈上皮具有重要的免疫效应和免疫支持作用
有研究发现结构细胞（例如神经细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、血管、成纤维细胞、上皮细胞）可以支持针对特定生态位的免疫反应的调整，这被称为“结构免疫“。而在牙周炎中这一概念尚未被充分探索。作者通过pseudobulk RNAseq分析发现了牙周炎中的牙龈上皮高表达免疫相关基因。使用CellPhoneDB工具，研究者们分析了不同细胞类型之间的细胞-细胞通信模式，除了发现预期的成纤维细胞-血管和成纤维细胞-免疫相互作用，也发现了许多角质细胞（特别是SK/JKs）与其他细胞类型之间的相互作用，提示了牙周炎中区域性上皮-基质-免疫通信轴的存在。特别是沟内上皮与适应性免疫细胞互作程度强，而结合上皮与天然免疫细胞互作强（图2）。作者重新分析了scRNA-seq中的微生物序列，以及利用RNAscope 检测16S发现了健康状态下细菌主要在上基底层细胞中，而在牙周炎中，上皮基底层细胞和基质细胞中的16S+数量增加，特别是在结合上皮JKs中更高。健康样本中细胞-微生物关联很少，而在病变样本中，每个细胞的细菌reads数量明显增多。例如牙周病原体牙龈卟啉单胞菌在上皮细胞中增加了近200倍。这些结果表明了牙龈上皮与微生物的互作关系非常重要。
图2 牙龈上皮的免疫效应、免疫支持和微生物互作关系
03 空间单细胞蛋白质组揭示了不同的牙龈上皮周围免疫微环境
为了验证scRNA-seq数据分析出来的结论，作者采用Phenocycler-Fusion(PCF)空间单细胞蛋白组技术研究了健康人和牙周炎患者的牙龈组织中疾病状态如何影响上皮细胞的免疫细胞模式。作者检测了33个抗体, 在牙周炎样本中结合上皮（JK）周围显示出更多的先天免疫细胞（MPO+中性粒细胞，CD14/CD68+巨噬细胞，CD56+自然杀伤细胞，CD11c+树突细胞），而沟内上皮（SK）周围则显示出独特的适应性免疫灶（CD8+细胞毒性T细胞，CD4+辅助T细胞，FOXP3+调节性T细胞和CD20+B细胞）(图3)。研究还探讨了SKs和JKs可能支持的独特免疫细胞-细胞相互作用，并发现不同类型的免疫细胞在JK和SK周围的相互作用模式存在差异。
图3 空间单细胞蛋白质组学揭示了上皮周围免疫微环境特征
研究者通过细胞互作和邻近网络分析了细胞类型之间的空间关系，分析了牙周炎中免疫细胞如何在微环境中形成特定空间表型。研究发现在牙周炎中存在免疫抑制的JK微环境，其特征是PD-L1+的上皮和基质细胞富集在结合上皮周围。此外，SK区域存在含有表达活性（ICOS+）和耗竭（PD-1+）细胞的三级淋巴结构(图4)。而这种三级淋巴结构很少在牙周炎中研究过。此外，研究还评估了包括增殖（Ki67）、免疫激活(GZMB, IFNG, Galectin-3, HLA-A, ICOS)、耐受(IDO1)、记忆（CD45RO）和耗竭（PD-1、PD-L1）在内的多种细胞状态，并在疾病中观察到结合上皮周围的免疫细胞表达更多的免疫激活相关标记物。
图4 沟内上皮和结合上皮微环境的空间分析显示了区域化和不同的免疫表型
总结与讨论
本研究通过单细胞RNA测序和空间单细胞蛋白组技术(Phenocycler-Fusion, PCF)，深入剖析了牙周组织中上皮组织的相互作用和免疫角色。研究发现，牙周炎不仅改变了上皮细胞的分化状态，还显著增强了其效应细胞因子的表达。研究揭示了特定细菌种类对牙周组织细胞的特异性趋向性，并通过空间单细胞蛋白组技术发现了这些细胞在牙周炎中的免疫微环境变化。这些发现不仅增进了我们对牙周炎微环境中细胞通讯和免疫调节的理解，而且为开发精准的牙周病治疗方法提供了新的策略和潜在靶点。
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相关文献
Easter QT, Fernandes Matuck B, Beldorati Stark G, et al. Single-cell and spatially resolved interactomics of tooth-associated keratinocytes in periodontitis. Nat Commun. 2024;15(1):5016.
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