研究：由 Eda 基因的重复固定而导致的棘鱼（Sticklebacks）平行演化

本文摘自文章 Widespread Parallel Evolution in Sticklebacks by Repeated Fixation of Ectodysplasin Alleles （Science，2005）

研究目的

先前的研究发现，淡水棘鱼约在 10,000 到 20,000 年前冰川广泛融化后，从海水棘鱼演化而来。但世界各地的淡水棘鱼都表现出相同演化趋势 —— 骨甲厚度降低。为了揭示这种平行演化背后的分子机制，作者设计并完成了此研究。

核心观点

1. 巨大的变化可以通过相对简单的遗传机制产生（如单突变）。
2. 平行进化既可能通过不同种群中的 功能相似的独立突变 而发生（如 NAKA），也可能通过对祖先中的 稀有常态突变 的 重复选择 而发生。

研究流程

1. QTL 定位

作者使用 QTL 进行粗定位，确定了 539KB 的区间，与棘鱼（Sticklebacks）骨甲表型相关。然后作者设计了平均间隔约 12KB 的 微卫星标记，利用标记与周围片段的连锁不平衡特性，将范围缩小到了16KB。此区间内包含 Eda 基因 的内含子 2（图 1）。锁定 Eda 基因的原因是，先前的研究发现，在哺乳动物中 Eda 是许多外胚层衍生物（例如牙齿、头发和汗腺）和真皮骨正常发育所必需的。另一方面，青鳉（Oryzias latipes）的 Eda 受体基因（Edar）的突变会导致大多数鳞片的丢失，这些鳞片是真皮骨骼的元素。综上，作者认为 Eda 可能是棘鱼骨甲形态演变的分子基础。

2. 序列分析

作者对海水群体和淡水群体的整个 Eda 基因进行了完全测序，找到了 269 个 SNPs 和 34 个 Indels，其中有 33 个 SNP 在Exon 中，4 个 SNP 改变了氨基酸序列， 1 个位点在不同种类鱼中保守（图 2b，第 4 个红点）。

3. 转基因验证

为了直接测试 Eda 信号水平的变化是否会改变棘鱼的骨甲发育，作者利用转基因技术向淡水棘鱼中注射了完整骨甲 Eda 基因的载体。PCR 基因分型证实，实验中所有棘鱼都是少骨甲纯合型。对照组 33 个个体都显示出预期的少骨甲表型（图 4A）。实验组 23 个转基因棘鱼中，有 14 只对转基因呈阳性（图 4B），其中 3 只在侧面和尾柄上产生了额外的骨板（图 4C、D）。注射含有相同转基因载体的个体没有产生额外的平板。这些结果证实了 Eda 信号水平的提高会导致身体侧面和尾部区域侧板的形成。

Eda 基因功能的验证使人们认识到：巨大的变化可以通过相对简单的遗传机制产生（如单突变）。

4. 分子进化分析

作者对 25个物种（海水 10，淡水15）中 1328bp 的 Eda 序列 构建了 分子进化树（图 3b）。发现除了 NAKA 淡水群体外，其余淡水群体都被划分进了同一个进化枝下。进化树反映除了 NAKA，其余淡水群体是由共同祖先进化而来，而 NAKA 则有独立的祖先。但前人对线粒体序列的系统发育分析否定了淡水鱼具有单一起源的可能性。另一方面，淡水群体的取样来自世界的各个海域，难以想象不同海域的淡水群体的祖先不是来自与各自海域的海水祖先，而是源自统一祖先。

为了进一步研究淡水群体是否具有多个起源，作者扩增了总计 20 种不同的海水（8）、淡水（12）群体的 25 个随机基因序列，得到了 193 个 SNP 位点，用 SNP 序列构建的分子进化树否定了淡水群体的单一起源假说（图 3c）。从随机基因序列进化树中可以看到，地理位置相近（序号相近）的群体被分进了同一个进化枝，支持了 淡水群体源自本地海水群体 的假说。

结合已有的研究数据，可以推测：

推测 1：新突变（拒绝）

1. 假设有多种演化方案可以降低个体的骨甲含量，其中单位点突变会出现最早，然后才是在单突变的基础上积累第 2、第 3 个突变。
2. 如果单突变的所有可能中存在强有益突变，且最优突变的有益性远高于次优突变，则最优突变将以绝对优势的频率固定下来。即使最优突变不是最先出现，也会快速清扫掉已有的其他突变（硬清扫）。
3. 棘鱼的骨甲表型变化就是由单核苷酸突变所导致的，如果此突变是最优突变且远优于其他单突变，则不同地理位置的淡水环境都将筛选出此突变，造成相同的结果。
4. 上述推测如果成立，则 Eda 基因及附近区间所构成的单倍型在淡水与海水群体中应该是基本一致的。但 Eda 基因的分子进化树表明，Eda 基因不是在本地海水 Eda 基因基础上因新突变而演化出来的，是来自于同一个起源。两棵分子进化树的差异，拒绝了这种可能，并且反映出 Eda 基因的演化是独立于群体（染色体、基因组）演化的。

推测 2：常态突变（可能）

1. 海水群体中一直携带有低频的有害少骨甲 Eda 基因型。
2. 因为少骨甲基因型 频率低，所以导致其 单倍型演化速度缓慢（单倍型的群体突变率低），而完整骨甲基因型占有绝对优势，其演化速率快且与基因组演化速率相同。在海洋祖先向不同海域扩展并形成各个物种的过程中，少骨甲基因型仍保持着较为 古老的单倍型，并且 单倍型数量少。
3. 由于染色体重组的存在，低频的少骨甲基因型与高频的完整骨甲基因型交叉互换概率远高于少骨甲基因型，经过几代繁殖，少骨甲基因型基本都会嵌入到完整骨甲基因型的染色体背景中。因为少骨甲基因型始终在选择压力下维持低频，所以它会不断的通过重组嵌入到主流的染色体背景中，即 重组使基因片段与周围区间的进化被分离开来。
4. 因为少骨甲基因的单倍型古老且种类少，所以 不同海域，不同物种内的少骨甲基因的单倍型基本一致。当海水群体进入到淡水中后，受选择压力影响，携带少骨甲 Eda 基因型的个体数量不断增加并各自进化。在相同单倍型的基础上进化，自然在构建进化树时被分入同一大枝中。

5. 单倍型分析

作者通过进行单倍型分析来研究推测 2 的可能性。作者测定了 25 个物种从 Eda Exon1 起始至 GJB1 为止长度约 30KB 区间的序列。从中挑选出在 完整骨甲单倍型中未发生突变，但在 少骨甲单倍型中发生了突变 的 SNP 位点来代表单倍型，总共得到由 22 个 SNP 所构成单倍型（图 4）。

图中 红色 代表 海水群体，深蓝 代表 淡水群体。从图中可以看出，淡水群体的单倍型与海水群体的单倍型来自于两种完全不同的单倍型，并且单倍型之间存在 重组 的痕迹。此单倍型也印证了 Eda 基因分子进化树的结果以及推测 2。

为了验证推测 2 中 “海水群体中一直携带有低频的有害少骨甲 Eda 基因型”，作者在两个地点（Navarro River in California，NAV；Little Campbell River in British Columbia，LITC）捕获了大量海水群体样本，并进行 Eda 基因的分型。其中 NAV 的109个样本中有8个样本是杂合子携带淡水Eda基因型，频率3.8%（8/218），LITC的302个样本中有1个样本是杂合子，频率0.2%（1/604）。这两个地点的海水群体支持了少骨甲 Eda 基因型不会被自然选择完全淘汰，会以杂合子的形式长期存在，为淡水群提供了源源不断的基因型来源。在最初适应淡水环境的过程中，如果少骨甲 Eda 在淡水群中因为随机遗传漂变而消失了，也会通过海水群体而得到补充。（worldwide evolution of the low-plated phenotype has occurred mainly by recurrent local selection for a family of alleles repeatedly brought into freshwater populations by marine founders.）

不过上述海水群体中少骨甲 Eda 基因型的频率不能保证即为 “突变-选择” 平衡下的频率。因为存在海洋棘鱼在繁殖季节与沿海溪流中的淡水棘鱼偶尔杂交的情况，所以频率中可能有部分来自于淡水群体。

另一方面，作者通过中性序列的进化速率推算了少骨甲单倍型产生的时间，约 200 - 1000 万年前，远早于上一个冰河时代末期海水群体向淡水方向进化的时间。

从单倍型图谱中可以清晰的发现，NAKA 淡水群体的 Eda 基因单倍型与海水群体一致。这一点在分子序列（图 2b）和分子进化树（图 3b）中也得到了佐证。作者认为这种现象的原因是 Eda 基因只是调控骨甲通路中的一个节点，NAKA 淡水群体可能在其他节点上发生了突变，使个体也出现了少骨甲的表型。NAKA 淡水群体的演化也说明了平行演化的另一种方式：相同选择压力下筛选出功能相似的突变。

可惜的是，由于 Eda 基因表达量过低，难以准确测定不同基因型对表达量的影响，所以不同基因型影响表型的分子机制没有被进一步研究清楚。