基因敲除和敲低

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已于 2023-12-06 23:00:59 修改

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分类专栏：笔记文章标签：笔记

于 2023-12-06 22:58:27 首次发布

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#影响基因表达的操作，过表达，敲低，敲除。#

转入额外基因表达载体，载体里面有一个强的启动子，可以使得后面目的基因高水平表达就是过表达。
敲除转入额外基因表达载体，导致后面基因无法表达。
敲低并不让基因消失，让基因不能翻译，mRNA不能翻译。

2种完成消除的技术

CRISPR

CRISPR-Cas9 来自于自然界里面的一个现象，细菌免疫功能（避免被噬菌体的侵染）。

细菌察觉到噬菌体DNA，插入这段DNA到自己的基因组里面去，clustered regulatory interspace short palestromic回文的（前后重复的意思）repeats （CRISPR区域）

CRISPR区域主要有3个区域组成

前导序列（启动子）重复序列（细菌自己的序列）和间隔序列（病毒的序列）（重复和间隔交替）

相当于细菌的自己的病毒库

CRPSPR这个DNA序列上游还有一系列的DNA序列，上面有很多基因，一系列都叫Cas基因，crispr associated gene，产生的蛋白质可以查找CRISPR这个序列到底存储了哪些病毒的DNA，这些蛋白质就针对这些DNA把病毒的产物给清楚掉，一些基因组和RNA啥的，CAS有很多种，有可能这些还一起干活。

CAS9是最好用的，一个蛋白质身兼多职，完成序列结合，把基因组切掉。

crispr cas9工作原理

前导序列可以让后面序列表达出来，会产生一个表达产物，这个表达产物最终经过一些加工，得到sgRNA，single（只有一段间隔序列）guide，可以引导后面的cas蛋白质去切除病毒的DNA。很多噬菌体遗传物质是DNA，sgRNA+Cas组成核酸蛋白质复合体，可以识别特定病毒DNA。sgRNA和病毒DNA是互配的完成特异性识别，cas9会识别他要接下来要切下来的DNA的某一段，并不是任何序列都能切。eg。识别PAM序列（proto spacer adjacent motif），NGG，只要有两个G，cas9就能坐过去了，这个时候就能完成复合体和病毒DNA的结合。

病毒DNA切掉之后就被消灭掉了，因为没有修复机制，但是人类有修复机制。

人怎么操作，去组学数据库里查你要敲的这段DNA，设计一个互配的sgRNA，构建一个表达zhili，zhili转入到宿主细胞里去，再转入一个zhili可以表达cas9的基因，两个zhili共同转录就有了有这个复合体的系统了，但不管是细菌还是真核细胞都有修复方式，其中一个就是非同源末端的链接，染色体被切一下断成两段都不稳定，细胞只能舍弃一些不重要的，所以可能去找同源染色体，但是太慢了，有个临时的紧急的不是很好但是能解决问题的方法，就是两段随便一连，中间就缺了一块。

Cre-LoxP

loxP是个DNA序列，cre是个重组酶。

自然界是从噬菌体里面来的，P1噬菌体功能：在侵染了细菌之后把自己的基因组整合到细菌的基因组里面去，用loxP位点去把宿主里和loxP长得像的区域，利用cre这个酶重组到了细菌里面去，跟着宿主一起去复制，噬菌体这时处于一个溶源状态，随着宿主一起去复制，如果宿主环境不好，感觉快挂了，病毒就赶快换地儿又从宿主DNA上用cre切下来产生子代病毒，拖出来再裂解掉，就产生传播。

cre重组酶对loxP之间的加工（咋加工没看到）

研究基因功能和基因表达，有些基因功能太强大以至于敲除这个基因细胞就活不了，有些基因的表达产物是细胞生存必须的。某些组织说不定可以，找一些组织特异性基因，奢侈基因启动子。

一般说突变就是功能丧失的突变，突变和过表达对应。

用组学（组学就是大量的），比如cre loxP把序列换掉，做一个sequence，sequence 同源 target到target gene，和要换成的标记基因（比如荧光），和二维码barcode。

PCR扩增出来知道标的哪个二维码就知道敲的哪个基因了。出来的量多（丰度多）就是敲了没什么影响。

转基因动物就是在囊胚的时候转进去。

RNA interference 基因敲低

真核细胞免疫用RNAi

怎么完成免疫？外源基因（病毒）来了细胞里面之后侵入到宿主的基因组里，可以产生一些double strand RNA，真核细胞一看就知道是外来的（dsRNA连细菌都不会产生这个东西），dicer 核酸酶，把双链切了，产生了一个21个 nt的核苷酸残基，这么大的一个RNA，叫siRNA，siRNA接下来和一些蛋白质复合，产生蛋白质复合物叫RISC RNA indiced silence complex，这个复合物是一个带着RISC核苷酸和蛋白质，RISC可以识别细胞里面互配的mRNA ，然后把mRNA降解掉，不让它完成转录表达。

真核细胞有时候故意产生一些miRNA和蛋白形成RISC复合物，完成真核细胞一些自身一些基因的mRNA清除，所以是真核细胞自己调控自己的方式。

怎么敲低，你人工合成siRNA，然后RNA和细胞共同fuyu或者转入细胞。最开始在线虫里面发现的，线虫吃大肠杆菌，然后细菌的RNA整合到了线虫让它不能繁殖。