干货分享： 『细胞培养』常见问题解答

       细胞培养是常见的生物医学实验，与之相关的操作包括细胞换液、传代、冻存、复苏、计数等，会涉及很多技术上的细节，尤其对于较为敏感的细胞，更应注意每一步的操作。


　　小威特别结合日常实验操作和国外文献资料，收集一些关于细胞培养的常见问题和解答，方便细胞培养人员参考：


　　 1、如果收到一管干冰运过来的细胞，能直接把它放到液氮中保存吗？


　　答：在很多情况下，干冰（-80°C）运输的细胞可以放回液氮，之后再进行快速解冻。然而，这样处理后可能降低细胞活力。对于一些敏感的细胞系，这可能使细胞复苏更加困难。这种现象被认为是由于温度变化导致的细胞内冰晶结构的改变。因此，建议细胞在收到后应尽快解冻和培养。最好减少在-80°C的储存时间，最好这种温度只用于运输。


　　2、从液氮中取出细胞复苏时，应采取哪些安全措施？


　　答：在液氮中的细胞冻存管如果没有完全密封，有液氮漏入，解冻时冻存管的气温急剧上升，可能会导致爆炸。因此，当从液氮中取出细胞时，建议佩戴护目镜和防护手套。复苏时，应将冻存管在37°C水浴中不断摇动，在1-2分钟内使冻存液完全融化。


　　之后用酒精棉球擦拭冻存管外壁，再拿入超净台内，将细胞转移到已加入10ml培养液的离心管内，1000 rpm下离心5～10分钟，弃去上清液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，置 5% CO2孵箱静置培养。

　　3、为什么应将细胞储存在液氮罐中的气相而非液相？


　　答：细胞储存在液氮气相中更容易复苏。而在液氮的液相中，如果冻存管没有正确密封或有泄漏，细胞与液氮直接接触，会使细胞解冻后活力受到影响。


　　4、对于悬浮细胞，如何更换培养基？


　　答：培养悬浮细胞可以只是简单地添加新鲜培养基（如果空间允许）或者通过离心（100×g 5分钟）从旧培养基中分离细胞，随后将沉淀的细胞再悬浮于新鲜培养基中。


　　然而，对于大多数悬浮细胞系，简单添加培养基是更好的方法。无论哪种方法，都需要细胞达到其最大饱和密度之前更新培养基。细胞的饱和密度在3×10 5至2×10 6之间，具体依赖于细胞系和培养条件（静置或搅动、氧合水平等）。


　　细胞必须稀释至较低的细胞浓度以允许足够的营养物质恢复，使细胞保持对数生长。假如只是简单地更换培养基而不降低细胞密度，细胞就会迅速耗竭培养基并死亡。


　　如果细胞被稀释到其最小密度之下，则会进入滞后期，生长非常缓慢，或者会死亡。每种悬浮细胞系的饱和密度和传代间隔都不一样，因此，每日细胞计数是监测悬浮细胞系的最佳方式。

　 　5、细胞培养推荐的CO2水平是多少？


　　答：尽管细胞培养体系中的CO2水平范围为0.03％~40%（通常大气中的CO2约0.03％），但最常见的在空气中不添加CO2或者CO2浓度为5％~10％。


　　调节培养基中碳酸氢钠的浓度以与气相中CO2水平达到平衡非常重要。细胞会产生CO2，同时需要少量的碳酸用于生长和存活。如果不添加CO2并且细胞大量繁殖，则可以使用4mM（0.34g / L）的无水碳酸氢钠。


　　然而，这时培养瓶盖子应拧紧。如果培养体系需要5％或10％的CO2，则在37℃下分别使用23.5mM（1.97g / L）或47mM（3.95g / L）碳酸氢钠，初始pH为约7.6。在这些条件下，应使培养瓶松盖或使用培养皿来保持气体平衡。


　　6、为什么一些细胞需要丙酮酸钠？我应加多少丙酮酸钠到培养基中？


　　答：丙酮酸盐是糖酵解途径中的第一个容易进出细胞的有机酸代谢物。 因此，培养基中添加丙酮酸钠能同时为合成代谢提供能量源和碳源，有助于维持某些特定的细胞，有助于细胞克隆或者在培养基中血清浓度降低时需要。丙酮酸钠还有助于降低荧光引发的细胞毒性。通常加入的丙酮酸钠终浓度为1mM。商品化的丙酮酸钠溶液通常为100mM储存液（100X）。

图 糖酵解途径

　　7、培养瓶、培养板和培养皿中的细胞密度是多少？


　　请参考如下数据：

细胞产量根据细胞密度1 x 106 cells/ cm2进行的估算。

细胞产量根据细胞密度1 x 105 cells/ cm2进行的估算。

　　多孔板中细胞的接种密度：


　　成像时最佳密度通常为7500-20000个细胞/孔（96孔板）和1000-4000个细胞/孔（384孔板）。  细胞密度过高会导致自动对焦困难，特别是如果细胞长满，并且挤在一起，通常会导致一些细胞位于焦点之外。细胞密度过低，导致许多空白区域和焦点损失，特别是在使用较高放大倍数时。接种密度可以通过在培养板上接种不同稀释浓度的细胞，并使其在实验条件下生长（可以促进或阻止生长）来评估。

图 细胞密度较高时妨碍成像