proteoCHIP EVO 96样品制备芯片可以让你的单细胞蛋白质组深度更上一层楼

今天依然是单细胞样本制备方法介绍，最近新出许多单细胞样品制备方法，实时学习，才不会落后挨打。

对单个细胞内的数千种蛋白质进行可重复的定量仍然具有挑战性。为了解决其中的一些局限性，我们推出了一种专用的样品制备芯片，即 proteoCHIP EVO 96，它直接与 Evosep One 连接。这与布鲁克 timsTOF 相结合，无需手动处理样品即可实现双倍的鉴定，最新一代 timsTOF Ultra 可识别多达 4000 个蛋白质，每个 HEK-293T 平均 3500 个蛋白质组，无需载体或运行之间的匹配。该工作流程跨越 4 个数量级，鉴定出 50 多种 E3 泛素蛋白连接酶，并在小分子刺激下分析关键调节蛋白。本研究表明，基于 proteoCHIP EVO 96 的 timsTOF Ultra 样品制备提供了足够的蛋白质组深度来研究细胞类型分类之外的复杂生物学。该工作流将proteoCHIP EVO 96 的自动样品处理、纳米流 Evosep One 方法的高峰容量和布鲁克 timsTOF 仪器的最佳离子使用结合到一个集成的无标记 SCP 工作流程中。

参考文献地址：https://www.nature.com/articles/s41467-024-49651-w

实验技术原理

proteoCHIP EVO 96 工作流程示意图概述，包括细胞分配、裂解、蛋白质消化、将单细胞转移到 Evotips 以及将 Evotips 上样到 timsTOF SCP。为了评估样品转移对肽回收率的影响，将自动转移和手动转移的实验方法进行对比，可以看出使用Evosep方法可以增加蛋白质鉴定数目。

实验步骤

（1）proteoCHIP EVO 96 是一种微机械加工的低吸附 PTFE 芯片，具有 96 孔板布局中的锥形纳米孔，为了进行样品处理，将proteoCHIP EVO 96插入cellenONE®中。

（2）将芯片温度降低至10°C会导致十六烷在锥形纳米孔内凝固。对于同时裂解和消解，使用了由MS兼容去污剂、蛋白酶（胰蛋白酶，10 ng/μL）和缓冲液（TEAB，100 mM）组成的预混液（MM）。

（3）在细胞裂解和蛋白质消化过程中，cellenONE®内的甲板温度升高至45°C，熔化十六烷并将细胞完全浸没在MM中，为了加强混合并改善细胞裂解，50 nL H2O在整个2小时的孵育时间内，每2分钟自动将添加到纳米孔中。

（4）为了将SCP样品直接转移到自动进样器中，proteoCHIP EVO 96被设计成安装在一盒Evotips的顶部。为了在将单细胞样品转移到 Evotips 时将十六烷保留在 proteoCHIP EVO 96 中，将样品体积增加到最终的 3 μL，并暴露在十六烷层上方。再次将 proteoCHIP EVO 96 冷却至 10 °C 使油重新凝固，使液体样品液滴与固体十六烷完全分离。

（5）随后，将冷却后的芯片倒置，以将每个纳米孔（即一个SCP样品）安装在每个Evotip的顶部，这些Evotip是用于Evosep One HPLC系统内在线脱盐的一次性捕集柱。

（6）通过离心，将溶液中消化的肽转移到尖端，同时将凝固的十六烷保留在每个纳米孔中，并从Evotip盒中取出现在为空的proteoCHIP EVO 96。然后，在离心机内手动洗涤所有Evotips，然后直接放置在Evosep One上进行色谱分离。

实验结果

1.样品通量增加一倍会降低蛋白质组深度，但仍能识别生物学相关的蛋白质

2.proteoCHIP EVO 96 SCP 样品制备反映了脂多糖处理后THP-1细胞的预期蛋白质组变化,基于 proteoCHIP 的工作流程示意图概述，包括 THP-1 细胞的 LPS 处理、无监督簇归一化和批次校正，然后进行差异表达分析。

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