二次扩增产物条带弥散_查尔酮合成酶基因的PCR扩增

【实验目的】

(1)掌握PCR扩增的基本原理。

(2)掌握PCR扩增查尔酮合成酶基因的方法及操作过程。

(3)了解查尔酮合成酶的功能及基因相关信息。

(4)熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的操作过程。

【实验原理】查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)是类黄酮类物质合成的关键酶，在苯丙氨酸合成途径中，香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A在CHS催化下产生苯基苯乙烯酮。在这一过程中，查尔酮为类黄酮类物质提供了基本的碳架结构，为类黄酮、黄酮醇、黄烷酮、花青素糖苷及其他物质的合成提供了保障。CHS基因广泛存在于高等植物中。研究人员已从裸子植物、被子植物中克隆到CHS基因，并对它们的功能进行了研究和分类。近年来，研究人员还从蕨类植物松叶蕨(Psilotum nudum)，甚至苔藓植物风兜粗裂地钱(Marchantia paleacea var. diptera)中克隆到了CHS基因或类CHS基因，为研究CHS进化提供了重要依据。CHS在植物诸多生理生化活动中起着重要作用，是近年来植物生理生化和分子生物学研究的热点之一。CHS基因的功能多样，涉及植物生长发育的诸多过程，主要表现在花色素合成、防UV照射、抵御病原真菌侵染、根瘤形成、植物育性、调节生长素运输和抗虫等方面。CHS基因的表达部位和表达时期也不尽相同，有的在营养器官中出现，有的则在生殖器官中表达，还有一些在外界环境的诱导下表达。搞清基因家族各成员的作用及相互关系，对系统研究CHS基因有着重要的意义。另外，CHS基因的起源较早，不论在低等植物还是高等植物中，都存在CHS基因或类CHS基因，CHS基因在植物分子进化研究上有着不可替代的作用。本实验采用PCR方法，利用引物克隆CHS基因的全长。模板DNA经若干个变性、退火和延伸循环后，目的基因扩增为原来的2n倍。

【实验材料、试剂及仪器】

1．实验材料白菜、甘蓝、芥蓝等芸薹属蔬菜的基因组DNA(20ng/μL)。

2．实验试剂

(1)基因特异性引物：CHSUP　5’－ATGGTGATGTGTACACCGTC－3’；CHSDN　5’－TTAGAGAGGAACGCTGTGC－3’。

(2)Taq DNA聚合酶(国产或进口)。

(3)10×Taq酶配套缓冲液(Taq酶配套)。

(4)25mmol/L MgCl2溶液(Taq酶配套)。

(5)4×dNTP溶液(与Taq酶购自同一公司)：dATP、dGTP、dCTP、dTTP各2.5mmol/L。

(6)琼脂糖凝胶电泳相关试剂。

3．实验仪器

PCR热循环仪(全班1台)制冰机(全班1台)0.2mL PCR管(每人3支)移液器(每2人1套)0.2mL转头的台式高速离心机(每4人1台)200μL、20μL、2μL吸头(若干)琼脂糖凝胶电泳相关仪器

【实验步骤】

(1)在无菌的0.2mL PCR管中配制20μL反应体系(冰上操作)：

反应物体积/μL终浓度ddH2O10×Taq酶配套缓冲液21×25mmol/L MgCl2溶液0.41.5mmol/L4×dNTP溶液0.4200μmol/L10μmol/L CHSUP溶液0.50.4μmol/L10μmol/L CHSDN溶液0.50.4μmol/LDNA模板0.50.5ng/μLTaqDNA聚合酶0.51U

(2)将反应混合液混匀，8000r/min离心5s。

(3)加入1滴石蜡油，8000r/min离心5s。(若PCR仪具有热盖，则此步可省略。)

(4)将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：

(5)取10μL PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

【典型实验结果分析】

1．理想实验结果(见图8.5)目的条带在1200bp处，条带单一，特异性高，可用于目的基因的胶回收实验。注意：利用CHSUP和CHSDN引物对，仅能从部分芸薹属蔬菜DNA中扩增到CHS基因，推荐选用白菜、甘蓝和芥蓝。

2．典型实验结果1(见图8.6)条带不单一，除目的条带外，在1000bp处有杂带，另外还存在条带弥散现象，这表明模板量过大或循环次数过多。解决办法：降低模板浓度或减少循环次数。

图8.5　PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果1

M：DNA分子大小标准参照物；1：PCR扩增产物

图8.6 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果2

M：DNA分子大小标准参照物；1：PCR扩增产物

4．典型实验结果2(见图8.7)无条带。解决办法：可能加样错误，出现了试剂或模板DNA漏加现象；也可能是模板浓度太低，建议加大模板量。

图8.7 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果3

M：DNA分子大小标准参照物；1：PCR扩增产物