剪切caspase3_Caspase-3活性检测

实验原理

Caspase-3是一种蛋白酶，属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族，在细胞凋亡中起着不可替代的作用。caspase-3可以被多种因素活化，在CTL细胞的杀伤作用中，它既可被Fas/FasL途径活化，也可以通过颗粒酶B途径活化。颗粒酶B是CTL细胞颗粒中的一种丝氨酸酯酶，是哺乳动物中除caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶，它可以特异性剪切ICE家族蛋白酶催化亚单位C端的XXD序列，并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。Caspase-3能催化特异性底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)水解生成对硝基苯胺,通过在405nm对硝基苯胺发色强度的检测来计算出caspase-3的活性大小。

试剂

2x反应buffer: 50mmol/L HEPES，pH7.4

100mmol/L NaCl

10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)

2mmol/L EDTA

10% 甘油

仪器

96孔酶标板及酶标仪

实验步骤

1底物溶解及稀释：Ac-DEVD-pNA用DMSO溶解配成储存液，临用时用1X反应buffer稀释成4mmol/L工作液，注意避光。

2对硝基苯胺储存液：将对硝基苯胺用无水乙醇溶解后，用1X反应buffer稀释配制成储存液。

3将重组人的Caspase-3用1X反应buffer稀释后，取50μl加入含有50μl的2x反应buffer的酶标板中，最后再加入5μl底物工作液，37℃水浴，避光反应2h。在405nm下读取OD值。将200μM对硝基苯胺储存液，用1X反应buffer进行2倍梯度稀释，在405nm下读取OD值，并绘制标准曲线。

结果计算

酶活定义：caspase-3在1min内水解产生1pmol对硝基苯胺为一个活性单位U。

比酶活：1μg caspase-3蛋白在1min内水解产生1pmol对硝基苯胺，U/μg

将酶标仪测定OD值带入对硝基苯胺绘制的标准曲线中计算得出的最终酶活

比酶活=

pmol/min/μg

重组人caspase-3最终活性为2196pmol/min/ug。