小分子php蛋白,小分子蛋白的WB条件摸索

小分子蛋白做WB有一些讲究，做了一段时间10-20KD的WB实验，有点体会，录于此备忘。并请各位老师批评指正。

WB的常规流程略。

小分子蛋白要用高浓度的分离胶，比如15%。

电泳我用恒压，电压太大会导致跑在最前面的小分子蛋白成锯齿状，70mV*30min浓缩胶，90mV*40min。另外，溴酚蓝跑到距胶底1cm以上，可分出目标蛋白即可，不必到底。

转膜我用湿转，恒流，电流太大或时间太长易转过，膜后再贴一张膜可检验，证实。感觉150mA*(30-40min)尚可。

转膜前的平衡时间短点，几分钟甚至1min就好。平衡所用的液体及转膜液成份相同，都不要加SDS，效果是天壤之别。

其它的WB相关细节(不限于小分子)还有：

脱脂奶粉封闭走个过场就行了，5-10分钟。

尽量用脱酯奶粉TBS液配一抗，自封口袋孵4度过夜，感觉比抗体孵育盒效果好，缺点是浪费抗体(但可回收啊)

二抗40分钟即可，摇不摇随便。

配分离胶时加超纯水，压气泡, 动作宜轻柔舒缓，尽量减少对分离胶的冲击，避免分离胶成分改变.

如果加样时稍稍离心，可使蛋白成分相对纯净，曝光时条带形态更好一点。

玻璃板烘箱烘烤后不能立即灌胶，如果不预冷至室温，将导致分离胶内明显气泡，这个有切身体会。另外，从冰箱内取出的凝胶试剂盒配制的胶据说也不能明显低于室温，需略等其升温，否则也易产生气泡。