蛋白质浓度与盐胁迫的关系_蛋白质的分离纯化（二）

从原料中抽提得到的蛋白质溶液一般蛋白质含量较低，并含有多种杂质。对抽提液进行初步提取，也称粗提或粗分级，主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。这一步的操作一般应该尽量简单快速，并且适于处理大量样品，所以以沉淀法为主，包括简单沉淀、分级沉淀等。

简单沉淀是一次性完成，分级沉淀是分次加入沉淀剂，使不同的蛋白质在不同沉淀剂浓度下分别沉淀，从而被分离开来。一般沉淀核酸、多糖等杂质都是简单沉淀，比如MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素等核酸沉淀剂。

分离蛋白一般会尽量避免变性因素，以保证目的蛋白的生物活性。但如果目的蛋白对某种变性因素抗性较强，也可以选择性地变性杂蛋白，从而实现快速纯化目的。例如提取卵黏蛋白时，因为其对酸的稳定性较高，所以可用2.5％三氯乙酸处理，使绝大多数杂蛋白变性沉淀。

分级沉淀法常用盐析或有机溶剂分级沉淀。这两种方法都可以简单快速地将总蛋白分成几组，从而起到纯化作用，所以是生化中分级沉淀经常采用的方法。其中盐析法不易引起蛋白变性，更为常用。

盐析是在溶液中加入大量中性盐，中和蛋白质表面电荷，破坏蛋白质水化层，从而使蛋白质沉淀。盐析一般在蛋白质的等电点进行，因为此时蛋白溶解度最小。最常用的盐是硫酸铵，其浓度一般用饱和溶液的百分数表示。因为加入硫酸铵时，溶液体积会有很大的非线性变化，不易计算，所以有人测定了溶液从某一浓度到另一浓度应加入的盐量，制成表格，便于使用。

硫酸铵饱和度表

盐析后样品中含大量盐类，通常不利于后续实验，要设法除去。实验室中常用透析或分子筛层析（如Saphadex G25）除盐。如果样品浓度过低，可用反透析、冻干、超滤等方法浓缩。

层析设备

初步提取得到的制剂一般可直接用于工业生产。科研一般需要高纯度样品，需要进一步精制。常用方法主要是各种层析、电泳，有时也采用结晶法。

电泳分离蛋白质

除结构分析需要晶体外，结晶也是蛋白质纯度高、构象正确的重要标志。因为蛋白质结晶过程需要其结构均一，所以变性蛋白是无法结晶的。因此，虽然蛋白结晶不能出去所有杂质，但可以除去构象异常的分子，这是其它方法难以做到的。

蛋白质晶体，引自IUCrJ. 2019 May 1; 6(Pt 3): 454–464. (g) hmDRS, (h) OMT ShuA. 标尺长度为 0.1 mm