蛋白质浓度与盐胁迫的关系_《Nature》子刊：药企福音！——降低蛋白质-聚合物药物的成本...

蛋白质是大生意。它不仅构成了每个生物的重要组成部分，而且还是一个每年产值1500亿美元的产业。无论是用于食品，药品还是制造业，几乎所有行业都需要蛋白质来制造其产品。但就药品而言，对蛋白质的需求也要付出高昂的代价，制药商迫切需要找到蛋白质纯化的成本的解决之道。制药业在制造蛋白质-聚合物药物时可以通过创新的方式来解决这一代价高昂的问题。近日，美国卡耐基梅隆大学的Alan Russell教授、博士生Stefanie Baker等研究人员，开发了一种新方法来纯化药物中使用的蛋白质-聚合物偶联物，以确保其正常运行。该研究成果以题为“Transforming protein-polymer conjugate purification by tuning protein solubility”的论文发表在国际期刊Nature Communications上(见文后原文链接)。

Baker说：“用于治疗的蛋白质和蛋白质-聚合物偶联物的纯度极其重要。治疗性蛋白必须是同质的，并且每批都具有相同的性质，否则，它们不会一次又一次地产生相同的治疗效果，而且可能实际上对它们本应帮助的患者有害。”

目前，几乎所有的商用蛋白质都开始使用硫酸铵沉淀的方法进行提纯。从这里开始，将一种蛋白质从另一种蛋白质中分离出来的斗争就变得非常复杂了，尤其是在蛋白质聚合物药物的情况下。偶联物必须从聚合物、天然蛋白质和同分异构体中分离出来。这在历史上给科学家们提出了一个真正的问题，这可能占到为病人生产蛋白质药物总成本的一半以上。然而，使用Baker和Russell的新方法，成本可以显著降低。Russell说：“我们一直对通过从蛋白质表面生长聚合物来设计蛋白质的溶解度很感兴趣。如果蛋白质可以被设计成在极端盐浓度下可溶呢？硫酸铵盐广泛用于浓缩蛋白质，因为它以50%左右的饱和浓度沉淀所有蛋白质。我们决定挑战一下自己，看看能否创造出一种溶解在完全饱和的硫酸铵中的蛋白质。”在过去的一年里，研究小组发现，通过从蛋白质表面生长共价聚合物，可以大大增加这些蛋白质在盐溶液中的溶解度。这样，蛋白质在盐溶液中溶解的速度就会比在盐溶液中沉淀的速度快得多，从而使它们更容易分离，只留下需要的纯蛋白质。与传统方法相比，这是一种更快速、更简单的提纯这些化合物的方法。该团队还与佛罗里达大学的一个由Coray M. Colina教授领导的领导小组进行了合作。Colina和她的学生制作了盐对蛋白质偶联物影响的计算机模型，以帮助理解正确的聚合物如何能把一个艰难的过程变成一个简单的过程。【图文解析】图1. 偶联物的合成和表征

解析：用ATRP接枝Lyz-聚合物共轭合成。一个带正电的ATRP引发剂首先与Lyz表面的可接近氨基反应。其次，利用ATRP以增加聚合物长度的方式生长两性CBMA或中性OEGMA聚合物。附加缩略词：抗坏血酸钠(NaAsc)，1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)。图2. 聚合物长度和接枝密度对偶联物溶解度的影响

解析：天然Lyz、Lyz引发剂和Lyz-聚合物偶联物在pH 7.0下经硫酸铵沉淀以确定其盐析点(图2)。天然Lyz沉淀约60%饱和硫酸铵(2.5 M)(图2a，b)。Lyz引发剂也在60%的饱和度下沉淀。可变接枝密度偶联物的硫酸铵沉淀(图2c，d)显示，具有最少量的聚合物Lyz(1+)pCBMA DP 14的偶联物不溶于可溶性硫酸铵。图3. 硫酸铵中两性离子的共轭稳定性。

解析：由于所有Lyz(5+)pCBMA偶联物的溶解度最高可达100％饱和硫酸铵，因此研究人员接下来研究了它们的流体动力学直径如何随盐浓度的增加而变化，以及偶联物的大小是否随时间变化。在Lyz(5+)pCBMA偶联物上再次进行硫酸铵沉淀，并在每次增加的硫酸铵浓度下对上清液进行DLS测量(图3a)。接下来，研究人员确定了聚合物长度对在饱和硫酸铵溶液中储存期间偶联物Dh的变化速率的影响(图3b)。短DP 18和长DP 91偶联物的流体力学直径在长达2.5个月的时间内都保持稳定。图4. 蛋白质-聚合物偶联原子MD模拟

解析：为了确定为什么两性离子聚合物与蛋白质结合防止盐析的分子基础，进行了原子分子动力学(MD)模拟。一方面，共轭两性离子聚合物可以防止蛋白质周围水合层的耗尽。另外，水化层可能会耗尽，但是带高电荷的两性离子聚合物的外壳会阻止蛋白质聚集和沉淀。研究人员还试图确定从MD析出Lyz-pOEGMA的早期机理。图5. 利用不同的盐析点进行纯化

解析：为了验证硫酸铵不会使结合物失活，利用溶解度的差异来纯化结合物和少量天然Lyz(10 µg / mL)的混合物。在优先沉淀之后，将样品在去离子水中透析以除去盐，然后进行超滤以获得具有起始混合物浓度的样品。Lyz(5+)pCBMA和Lyz(5+)pOEGMA凝胶泳道显示出聚合物共轭后的典型谱带展宽，并且分子量比天然Lyz高(图5)。可以在起始混合物中看到天然Lyz和Lyz(5+)pCBMA，并且在优先沉淀后，上清液中天然Lyz的谱带明显下降(图5a)。在ImageJ中分析凝胶，比较纯化前后天然Lyz带的强度，以从0.01 mg / mL的起始浓度估算最终浓度为0.003 mg / mL。【未来工作展望】

既然他们的方法已经被证明是有效的，Baker和Russell计划接下来的工作要证明该方法在商业生产所需的规模上是有效的。尽管这是一项艰巨的任务，但该团队对生物制药的未来持乐观态度。Russell说：“这些蛋白质可以被设计成溶解在其他所有蛋白质都无法溶解的溶液中，这一发现可能会真正简化这些结合药物的制造过程，并使它们在未来变得更便宜。”

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-019-12612-9

来源：高分子科学前沿

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