蛋白质浓度与盐胁迫的关系_蛋白质浓度测定方法

蛋白质浓度测定方法 根据蛋白不同性质建立的蛋白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩尿法、Lowry法、BCA法、胶体金法 染色性质：考马斯亮蓝法、银染法 比色法原理：蛋白质组成成分氨基酸与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质，有色物质的浓度与参与反应的蛋白质氨基酸数目有关，从而反应蛋白质浓度。 蛋白浓度直接测定(UV法) 原理：在280 nm波长直接测试蛋白质选用Warburg公式光度计可以直接显示出样品的浓度，或选用相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度 简易经验公式：蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45OD₂₈₀-0.74OD₂₆₀)*稀释倍数 精确计算：蛋白质浓度(mg/ml)=F(1/d)OD₂₈₀*稀释倍数           F：校正因子，通过计算OD₂₈₀/OD₂₆₀，然后查表得到           d：测定OD值的比色杯的厚度 优点：测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质； 相比于比色法速度更快，操作简单。 缺点：适合测试较纯净、单一的蛋白质溶液； 容易受到平行物质的干扰，如DNA、RNA； 敏感度低，要求蛋白的浓度高。 紫外吸收法 原理：大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸(酪氨酸和色氨酸)残基，使蛋白质在280 nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度成正比，以光密度为纵坐标、标准蛋白溶液为横坐标，绘制出标准曲线，根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。 测定范围：0.1-0.5 mg/ml 优点：低浓度盐类不干扰测定 双缩脲法 原理：在强碱性溶液中，蛋白质中的肽键与CuSO₄形成紫色络合物，紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法定量。 注：双缩脲(NH₂CONHCONH₂)是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

双缩脲的制取 测定范围：0.5-10 mg/ml 优点：此法简便，受蛋白质氨基酸组成影响小。 缺点：灵敏度小、样品用量大； 干扰物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸。 Lowry法(福林-酚试剂法) 原理：显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu²⁺结合生成复合物并被还原成Cu⁺，Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正相关。 测定范围：25-250 μg/ml 优点：灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。 缺点：受蛋白质氨基酸组成的影响，即不同的蛋白质中酪氨酸和色氨酸量不同使显色强度有所差异；酚类等一些物质的存在可干扰测定结果。  BCA比色法 原理：碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与Cu²⁺形成络合物，并将Cu²⁺还原成Cu⁺，Cu⁺再与BCA试剂(4,4’-二羧酸-2,2’-二喹啉钠)相互作用，两分子的BCA螯合一个Cu⁺，生成紫色络合物，在 562 nm处具有强吸光值，其强度与蛋白质浓度成正比。对氨基酸没有选择性。

BCA 测定范围：10-1200 μg/ml 优点：是Lowry法的改进方法，相比Lowry法BCA法试剂单一、终产物稳定，灵敏度更高(微量检测可达到0.5μg/ml)，几乎没有干扰物质的影响，尤其在Triton-100、SDS等表面活性剂中也可测定。 缺点：螯合剂(EDTA、EGTA)、还原剂(DTT、巯基乙醇)和脂类影响结果。  Bradford法 原理：考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当通过范德华力与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，检测化合物在595 nm的吸光值，可计算出蛋白质的含量。测得的主要是碱性氨基酸和芳香族氨基酸。 注：考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

考马斯亮蓝G-250 检测范围：25-200 μg/ml，最小可检测2.5 μg/ml 优点：快速简便，10 min左右即可完成；干扰物少，NaCl、KCl、MgCl、乙醇、硫酸铵无干扰；强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，可用适当的缓冲液对照扣除其影响；Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及微量去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉，但浓度超过0.2%的去污剂(如TritonX-100、SDS、NP-40等)对结果有影响且不易消除。 缺点：蛋白质浓度高时非线性；小于3000Da的多肽无法测定。 凯氏定氮法(Kjeldahl) 原理：蛋白质有恒定的含氮量，平均为16%，因此测定蛋白质的含氮量即可计算其含量；含氮量的测定：蛋白质经硫酸消化为硫酸铵，碱性时蒸馏出NH3，用定量的硼酸吸收，再用标准浓度的酸滴定，求出含氮量。 蛋白质的含氮量为16%，即1g蛋白质中的氮相当于6.25g蛋白质。