ncbi查找目的基因序列_手把手教你调取目的基因mRNA并构建质粒(上)

获得目的蛋白是在研究蛋白功能或者做抗体发现的过程中必不可少的一步。现在获取蛋白的来源很多，可以直接跟一些公司买成品也可以去一些CRO做定制服务，还可以自己扩出目的基因构建到载体中进行表达。如果是少量的蛋白直接购买不仅可以省时间也确实能省不少的事，但是如果是大量的蛋白大部分人可能还是选择自己表达纯化。因为直接买可能比较贵，毕竟没有谁的钱是大风刮来的。

前面一篇文章介绍了通过NCBI和uniprot来调取蛋白质的序列及相关信息，为了省去大家回头再看一遍相同的东西，我准备写一个从序列查找到构建的文章。今天给大家介绍一下mRNA序列的调取方法和途径。

   mRNA即信使RNA，是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸，也是指导蛋白质生物合成的直接模板。下面将介绍几种获取mRNA序列的方法。

1、  第一种方法是NCBI:

百度搜索NCBI，搜索结果第一个即是官网，

点击官网即进入主界面，在首页“All Database”选择框中选择“Nucleotide”

这里以PD1为例，在搜索栏中输入目的基因“PD1”，点“Search”，即出现以下界面。

这里会出现许多结果，在右侧“Resultsby taxon”中点击“more”就可以看到这里面显示的有哪些物种，选择你想找的物种，比如人，就点击“Human sapiens”后面的括号数字“(369)”；

进去之后出现许多结果，这里有时候第一个即是想要得到的结果；有时候需要自己找一下，比如这里前面几个都是不同转录变异体序列，我们想要的能直接合成PD1蛋白的mRNA序列是第16项，如下图所示：

点击进去，下拉能够看到有PD1基因的详细介绍，包括氨基酸序列、及核苷酸序列，即为其mRNA序列。

2、  第二种方法是UniprotKB:

在官网的搜索栏中输入“PD1”，搜索结果中找到Homo sapiens (Human) 对应的项目，

点击“Q15116”进入详细信息页面,找到详细信息中的Sequence databases/RefSeq，这里面的NP和NM即分别对应该基因的蛋白序列和mRNA序列。

点开NM_005018.2，下拉页面就找到了mRNA序列：

以上是两种查找mRNA的方法，接下来就可以根据序列设计引物从cDNA中把目的基因扩增出来。我们的目的是要把PD1的胞外区(ECD)构建到pcDNA3.1中，在PD1的C端加上His tag助于后期的纯化。根据uniprot里面的信息我们选择了从胞外区的Leu 25-Gln 167。

从NCBI里面复制相应的序列，粘贴到snapgene里面。

我们把目的基因插在信号肽以及His标签之间，下面是我们的质粒图谱。

物的设计方法比较简单：正向引物一般从第一个碱基开始，长度不低于18bp；反向引物从最后一个碱基开始，同样长度不低于18个碱基；退火温度控制在57℃-62℃之间比较好；其他原则基本不需要考虑，一般都能够扩增得到正确的目的基因序列。

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