通常进行实时PCR(通常称为qPCR)以定量靶序列的绝对量或比较样品之间靶序列的相对量。该技术通过扩增过程中发出的靶标特异性荧光信号实时监测靶标的扩增。尽管实时PCR荧光染料和探针应具有序列特异性，但在大多数实时PCR实验中仍会产生大量背景荧光。为了收集有关目标的有意义的信息，绕过或考虑该背景信号至关重要。实时PCR中的两个值可解决此问题：阈值线和C q值。
阈值线是检测水平或反应达到高于背景水平的荧光强度的点。在进行PCR之前，您(或循环仪中的软件)设置阈值水平。从字面上看，这是图形中的一条线，表示高于背景荧光的水平，它也与您的反应曲线在指数阶段开始时相交(图1)。
C q 值或循环定量值是样品反应曲线与阈值线相交的PCR循环数。该值表明从样本中检测出真实信号所花费的周期数。实时PCR运行将为每个样品提供一条反应曲线，因此会有许多C q 值。循环仪的软件会计算并绘制 每个样品的Cq 值。
C q 值与样品中靶核酸的量成反比，并且与样品中靶拷贝的数量相关。较低的C q 值(通常低于29个周期)表示大量的靶序列。较高的C q 值(38个循环以上)意味着较低的目标核酸量。高C q值也可能表明目标或PCR设置存在问题，这将在本文的陷阱部分中概述。
您的PCR仪器将在每个循环中收集荧光数据。在大约15个循环后，您将对背景荧光水平有个很好的了解-从零个循环点开始，它将显示为一条直线。阈值水平将略高于此阈值，但是此时您的样品开始进入PCR扩增的指数阶段。如今，计算机软件可以计算出该精确点，所有现代实时循环仪都具有自动阈值线设置。
实时PCR记录所有PCR组分都丰富的反应过程中发出的荧光量。通过这种方式，C q 值通常在实时PCR中重复之间是一致的。到达到PCR反应终点时，累积的抑制剂，灭活的聚合酶和限制性试剂会在终点值上产生很多变化，这就是为什么常规PCR无法定量使用的原因。
常见陷阱
许多因素都会影响您的C q 值。 您的样品之间C q值的某些差异将归因于生物学事件，例如响应治疗后目标基因的上调/下调。然而，C q 值同样容易受到PCR反应的准备和PCR组分本身的影响。最常见的陷阱区域是：
1.预混料
溶液中的pH和盐浓度会影响荧光发射。荧光发射的任何变化自然都会改变您的C q 值。因此，请确保仅使用高质量的PCR组件，如果使用自制溶液，请在每次实验前检查pH值并监测盐沉淀。
2.被动参考染料
反应值是FAM(报告物)染料与ROX(无源参照物)染料的荧光比。假设FAM荧光不变，则较低的ROX产生较高的反应值。
3.反应效率
PCR反应效率取决于预混液性能，引物的特异性，引物退火温度和样品质量。通常，高于90％的PCR效率是可以接受的。100％的PCR效率表明目标靶序列在每个循环中加倍。完美的PCR效率与模板10倍稀释液之间3.3个周期的变化相吻合。
要确定每个引物对的PCR效率，请使用5个10倍稀释步骤对模板进行系列稀释，然后计算R 2，这是一种统计量度，用于描述一个值可以预测另一个值的程度。为了使PCR效率接近100％，您的R 2值应大于0.99。对标准曲线上的每个点至少运行三个重复。较高的复制数量对于低复制数量的输入尤其重要，因为在这种情况下，跨复制的可能性更大。
假设您已经排除了上述3个因素，则导致C q 值延迟的最常见原因是：
模板太少–尝试使用更多模板。
次优核酸分离–考虑您的核酸分离方案，定量DNA，运行琼脂糖凝胶，尝试其他方案/试剂盒。
cDNA合成过程中逆转录酶活性差-逆转录酶对降解敏感。订购新的。
RNA / cDNA降解–保持工作区清洁，改善RNA处理行为，避免cDNA多次冻融。
PCR抑制–您可以在此处阅读有关PCR抑制的所有信息。
其他原因包括细胞系/培养物中的感染或污染，但是这些问题通常是在核酸分离之前发现的。
调用三角洲三角洲C ^ q
要确定C q 值的变化是由于实际的生物学变化而不是技术问题引起的，您需要将结果标准化。最流行的归一化方法称为“ Delta-DeltaC t ”或Livak方法。在这里，你比较C q 您的样品到C的值q 的几个值参考(管家)的基因。
必须选择在实验期间其表达水平不会改变的参考基因。常见的管家基因包括肌动蛋白，α-微管蛋白，GAPDH和泛素。明智的做法是至少使用两个参考基因，并记住，一项研究的参考基因可能不适用于另一项研究。
Delta-Delta C q 方法是一个关键假设，即您的参考样品和目标样品的扩增(PCR)效率几乎为100％，彼此之间的误差在5％之内。其他归一化方法包括Dealt-Cq方法和Pfaffl方法。您可以在此处阅读有关qPCR数据分析方法的更多信息。
进一步阅读
McBryan's Musings：qPCR标准化
实时PCR C t值(威斯康星大学)
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