1流式细胞术荧光比值计算_你的流式细胞仪检测光子的能力如何?

1 简介

在流式细胞仪中，粒子或细胞与聚焦激光束相交时的受激光激发和光电探测器对发射光的检测通常被认为是随机过程。取决于在时间采集窗口的时间间隔内最终到达光电探测器的光子数，在每个间隔内收集的特定能量(波长)波段的光子数的分布由泊松分布(<100个光子)或由中心极限定理(数百、数千或更多个光子)的高斯分布来描述。通用流式细胞仪通常能够检测给定细胞或粒子的几百到数百万个光子。虽然泊松分布通常是合适的，但较亮的光强分布在形状上可以很容易地认为是接近高斯分布的。

典型检测布局的示意图如图1所示。粒子或细胞暴露在一个紧密聚焦的激光或强光源下，从而发出散射光和荧光光信号。产生的光子由透镜收集，由反射镜或光纤引导到光学滤光片块，然后引导到光电探测器。粒子产生光子的效率取决于粒子/细胞内和粒子/细胞上荧光分子的数量和分布，或者如de Rond等人[1]的最新出版物所述，粒子/细胞的光散射截面。如果来自细胞/粒子的光发射是各向同性的(荧光和一些小粒子光散射信号)，则收集光学元件相对于粒子/细胞的位置将不重要，并且如果来自细胞/粒子的光发射是各向异性的(大多数大粒子光散射信号)，则收集光学元件相对于粒子/细胞的位置将是重要的。对于给定位置的收集光学元件，光收集光学元件的光收集锥角(数值孔径)将决定在该位置将收集多少光。收集到的光通过准直透镜、光纤和滤光片进行处理，并指向光电探测器。光通过(或被反射)每个元件和在每个元件表面时都会有丢失。即使每个元件表面(滤光片或透镜)的光损失很低，例如，1%，在6个元件表面后，损失为6%；在10个元件表面后，损失为10%，依此类推。因此，对于复杂的滤波器配置，总损耗可以快速累积，以便当光子到达光电探测器时，只剩下一小部分初始光子。光电探测器具有转换效率，可进一步减少转换为光电子以产生电流的光子数量。从激光激发粒子/细胞-通过光收集配置-到光电探测器的整体探测效率可能非常小，有时开始时大大低于百分之一。这种光的损失被称为探测效率，或Q。对于荧光粒子，Q指与细胞/粒子相关的荧光分子的数量。在de Rond等人最近提交的报告中，探测效率与总光散射总截面有关[1]。