BODIPY脂滴染色流式荧光检测-Beckman流式仪-Summit流式数据分析软件

BODIPY脂滴染色流式荧光检测

探究在RA和OA的刺激下BMEC脂滴分泌的变化情况，之前因为共聚焦在区域选择方面认为影响因素较大，所以此次选用流式直接查看整体的分泌情况

• 样品流水号对应设置浓度如下

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
OA100	OA200	OA300	OA400	OA500	CON	OA50	OA100	OA150	OA200	CON

• 操作步骤如下

  • 吸出培养基，PBS清洗两遍
  • 400μL胰酶消化，1mL完全培养基终止消化，转移至1.5mL棕色避光EP管里
  • 1000rpm离心5min，弃上清
  • 每管加入1mL 1μg/mL的BODIPY室温避光染色15min
  • 离心，弃上清，PBS重悬离心弃上清，洗两到三遍
  • 400μL PBS重悬后上机

• 流式下机数据处理

  • 在summit软件里导入.fsc文件后（设置为英文路径），双击右侧如下标志，在analysis中打开需要设置的第一个样品
    

  • 第一步，调出细胞群

    • 所有细胞：左列为x轴，右列为y轴，选择后双击蓝色空白处
    

    • 有荧光强度的细胞

      

    • BODIPY-log荧光强度

    

  • 圈出细胞群，设门；右键-Polygon-圈目标群
    
    

  • 图一设的门圈至（挪至图2双击）图二，接着图二用rectangle方形圈门右键set gate移动至图三，图三则为圈到的信号强度。通过设门选取目的细胞，调整荧光信号形状对称性，去除杂信号等
    

  • 设置好门后，在右侧菜单栏书本标志的analysis中选出其他样本进行比对

结果比较方法一

• 按照上述步骤将样本信息一一导出后结果如下可利用Mean这一列的值做柱状图分析影响大小（我这次是预实验只是大概看一下所以没有设置复孔），如果浓度梯度有效果，配合共聚焦的荧光图一一对应放结果图里是最直观的

浓度	流水号	Region	Count	% Hist	% All	Bounds	Mode Count	Mode	Mean	Median	Std Dev.	CV	CV (hm)	Skew
OA100	1	Total	17047	100	34.29	(1.00,100000.04)	1117	53.15	51.88	48.56	17.63	33.97	24.88	1.96
OA200	2	Total	15495	100	22.92	(1.00,100000.04)	890	63.67	62.16	60.86	20.81	33.48	29.9	0.89
OA300	3	Total	16151	100	28.42	(1.00,100000.04)	1032	53.15	54.81	53.15	17.05	31.11	29.92	0.9
OA400	4	Total	15889	100	25.23	(1.00,100000.04)	899	60.86	65.18	63.67	22.2	34.06	34.09	1
OA500	5	Total	15322	100	20.92	(1.00,100000.04)	788	55.6	56.09	53.15	21.57	38.45	36.64	1.2
CON	6	Total	19274	100	57.04	(1.00,100000.04)	1592	18.82	20.19	18.82	5.92	29.34	23.24	2.09
RA50	7	Total	18653	100	53.38	(1.00,100000.04)	1121	33.84	35.57	33.84	12.62	35.48	31.28	1.99
RA100	8	Total	18774	100	49.51	(1.00,100000.04)	1227	69.68	69.29	66.61	23.16	33.43	26.03	1.52
RA150	9	Total	18642	100	60.15	(1.00,100000.04)	1382	55.6	59.44	55.6	18.63	31.34	23.24	1.7
RA200	10	Total	18575	100	56.13	(1.00,100000.04)	1319	72.9	76.05	72.9	23.98	31.53	24.67	1.54
CON	11	Total	18917	100	43.65	(1.00,100000.04)	1504	24.67	25.55	24.67	7.51	29.38	23.24	1.69

结果比较方法二

• 需要比对的样本按照上述方法（皆在Histogram下）一一从Databases samples目录下双击样本拉进来，按照上面的步骤选出三幅图的横纵坐标，然后设门这一步为保持一致性直接复制对照组的“门”进行set（比如我这里6号是对照组，就直接复制的6号的框选区域），比如我这里前两幅图都圈了门则都要一一复制，接下来用这3组数据（6/3/5示例）

• 注意：一组样本要用同一组门才有可比性（所以按照第一步直接复制粘贴门）

• 结果如下
  

• 因为我这里的目的是想看实验组与对照组相比，BODIPY的绿色荧光强度是否有变化（峰的偏移），所以在前面设门一致的条件下，将三个（这里示例用了三个）over在一起直接比较，以便直观看出。接下来进行overlay，左上角由Histogram切换到overlay之后，参照原来的第三幅荧光峰图，在Log Area选项下选择BODIPY-Log…之后同前一样双击蓝色空白处，出现新的图表框（此时是空白），单击新图标框的左上角，选择添加数据Add Data之后，双击每一组数据的第三幅图，也就是荧光强度值进行添加，就在新图表框中出现了下面我框选出来的红绿紫三个峰
  

• over完成之后如下，与红色对照6号样本相比，3号和5号样本都出现了明显的峰向右偏移，荧光强度增强，legend同样可以单击左上角调出
  

• 这个结果如果明显同样可以再做一个共聚焦一起看一下