宏基因组应用_宏基因组在水产上的应用

很早之前就对宏基因组，宏转录组什么的十分感兴趣，所以这几天看了看中文文献稍微了解了一点，便总结了一下。

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宏基因组是指生态环境中全部微生物基因组的总和，宏基因组学以基因组学技术为基础，研究环境中微生物的多样性、种群关系、功能关系及与环境间的关系，无需人工培养微生物，直接提取环境中微生物混合基因组 DNA 并测序，从群落水平上解析微生物活动，挖掘微生物新资源。一般来说，宏基因组学研究采用相似的步骤： 特殊的环境中提取微生物的 DNA；DNA用于直接测序、分析或者构建 BAC 文库用于测序以及功能筛选。有学者在web of science中分别以主题词: lake ＆ marine ＆ ocean ＆ soil ＆ atmosphere ＆ air ＆ metagenom* 对 SCI-E 数据库时间范围为 2008-2018年的文献进行检索． 检索时间为 2018 年 11 月 20 日，检索文献类型界定为“论文”和“综述”，不包括会议录文献、会议摘要、书评、信函、社论材料等． 共检索到文献 3551 篇，其中涉及湖泊文献 282 篇，海洋 1474 篇，土壤 1125 篇，大气及其他环境 670 篇，其中关于湖泊和海洋文献占总体文献的49%，说明在这两个领域中宏基因组的作用很重要。并且相关文献每年都增加的趋势。

1 宏基因组的研究策略

宏基因组的研究流程为：样本和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组DNA；构建宏基因组DNA文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图1)。

1.1 环境样品及目的基因组富集

在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总DNA 的一小部分, 对环境样品的预富集可以大大提高目的基因的检出几率。目前预富集技术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。其中细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对目的微生物进行富集培养, 最常用的方法是底物选择, 此外还包括营养选择及物理化学指标选择。基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术(SIP), 原理是采用稳定同位素标记底物, 其中的“重”原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中, 采用密度梯度离心的方法将“重”的 DNA 与“轻”组分分离, 被标记的“重”核酸可以作为 PCR 的模板, 用来构建宏基因组文库。

1.2 宏基因组DNA的提取

近年已有多种宏基因组 DNA 的提取纯化方法陆续建立起来, 大体可分为两类: 一类是直接提取法, 又称原位提取法。这类方法不经过样品中微生物的培养和分离, 通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使 DNA 得以释放, 并对 DNA 进行纯化。其中以 Zhou 法和 Tsai 法最为常用；另一类是间接提取法, 即异位提取法, 是利用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来, 再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞提取 DNA

1.3 宏基因组文库的构建

载体的选择: 载体选择在宏基因组技术中占有十分重要的地位。载体系统的选择主要依赖于DNA 提取质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌及筛选方法。根据克隆载体的不同宏基因组文库可分为质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库、噬菌体类载体文库。

宿主细胞的选择: 不同的微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异。宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基因的表达、目标性状(如抗菌)缺陷型等因素。其中 E. coli 是最为常用的宿主细胞, 其优点是操作简单、繁殖迅速、培养代谢易于控制。但是由于环境样品的总 DNA 有很大一部分为真核基因组DNA, 其在细菌宿主中往往不能表达, 大大限制了这部分基因的筛选。

1.4 宏基因组文库筛选

根据筛选原理大体分为两大类: 序列依赖性筛选法和非序列依赖性筛选法。

1) 序列依赖性筛选法, 是根据文库中的已知序列或保守序列来设计杂交探针或 PCR 引物, 从宏基因组文库中筛选目标序列。该法克服了功能筛选法中必须依赖表达后的活性产物进行检测, 效率较高。其中已知功能基因 PCR 扩增技术是最为常用的序列依赖性筛选法。

2) 非序列依赖性筛选法, 其不依赖于任何已知序列信息, 仅根据文库克隆子产生的活性物质进行筛选。其中以功能筛选法最为常用, 原理是直接对目的克隆表达的性状在选择培养基上进行筛选, 。该法筛选能够发现全新的活性物质或全长基因, 但工作量大、效率低, 生物转化的产物仅在少数情况下具有可见性状, 酶活性的检测受到研究方法的限制。

2 宏基因组在水产生态上的应用

2.1 水体污染

Luo 等人通过富集培养从东太平洋深海沉积物中分离出一株能以甲醛为唯一碳源和能源的降解菌，18SrRNA序列分析鉴定其为产黄青霉 DY-F2。研究人员可以通过构建污染水域的宏基因组文库，筛选有降解靶标物质能力的克隆，将其中的功能基因组成能降解污染物的功能基因簇用于分解环境中的石油烃及其他有毒化合物和重金属。Tremblay 等人利用加拿大西部和东部海岸石油降解潜力微观实验中提取的宏基因组和元转录组数据估计了在分散剂存在下石油降解细菌的基因丰度和活性，发现原油中添加分散剂主要有利于原油中两种重要的天然降解菌在夏季和冬季的富集，为分散剂在海洋环境下的石油泄漏治理中的应用提供支持数据。这些研究都为环境污染的治理提供了新思路。

2.2 生物群落的功能特征

淡水湖泊水体富营养化以及随之而来的蓝藻水华暴发已经成为世界范围关注的重大水环境问题。通过宏基因组学研究不仅揭示了蓝藻物种组成的变化伴随着蓝藻界内异养细菌群落的显著变化，而且还获得了蓝藻与异养细菌之间相互作用的证据。通过对惠氏微囊藻 T100 及其附生细菌群落进行功能分析发现，附生细菌不仅为微囊藻提供必须的维生素，还能够消除周围环境中对微囊藻生长不利的因素，从而使微囊藻在条件适宜时迅速形成水华，同时产生更多的次级代谢物供附生细菌生长，这种互利关系有助于微囊藻和附生细菌在复杂的水体环境中更好地生存。此外，研究发现尽管微囊藻本身无法固氮，但是其与附生微生物作为一个整体可以进行固氮，这可能成为非固氮蓝藻在氮相对缺乏状态下获得竞争优势的重要原因。

宏基因组在水体病原菌的检测方面也很有帮助，其中细菌、真菌和病毒都可以在水体中轻易的检测到，精准且全面。

2.3 获得水域不可培养微生物基因组信息

Vavourakis等在高盐湖泊的宏基因组样品中，利用 Binning 手段获得了分属于细菌、古菌等 45个门的 871个 MAGs(其中 154个MAGs 达到高质量 MAGs 标准，717个满足中等质量 MAGs 标准)，并且对所有 MAGs 进行了系统发育分析和碳、氮、硫循环相关功能基因分析。结果显示包括 Actinobacteria 在内的至少4个门(phylum)中，存在与湖泊碳固定和异化相关的未知微生物。

2.4 开发新型活性物质

海洋微生物丰富的天然产物结构类型是新型生物活性物质的重要来源。目前人们从海洋中分离到的化合物主要包括肽类、生物碱类、神经酰胺、内酯类、醌类、酮类、萜烯类及甾体类等，其中的某些活性物质具有抗肿瘤、抗菌能力。Wang 等人发现深海沉积物中的真菌 Acrostalagmus luteoalbus SCSIO F457 产生的两种吲哚二酮哌嗪对四种恶性肿瘤细胞系有抑制作用。Lin 等人从 1300 米深海沉积物样品中分离到一株对卤虾幼虫具有较强毒性的青霉属真菌，从其培养物中分离纯化了一种新的倍半萜醌类化合物青霉素 A，该青霉素 A 对小鼠黑色素瘤（B16）、人黑色素瘤（A375）和人宫颈癌（Hela）细胞株的体外增殖有一定的抑制作用。

2.5 其他作用

水产动物肠道微生物也是宏基因组研究的热点，因为鱼类肠道微生物不光可以反映出鱼类的食性还可以与免疫相关。水产动物食品安全和贮藏问题也可以使用宏基因组测序进行研究，朱迎春等人利用宏基因组分析鲶鱼肉片在贮藏的过程中微生物多样性和菌落动态变化，探究天然保鲜剂对鲶鱼肉片菌相及菌落组成的影响。

3 总结与展望

1998年Handelman首次提出了宏基因组的概念，此后宏基因组就在医学、生态学、农学和微生物等多个领域发挥了很重要的作用。在水产上，宏基因组的起步比较晚，但是得到了很快的应用与发展。虽然宏基因组学研究手段绕过了传统微生物培养的弊端，以大数据测序文库覆盖样品中所含有的尽可能多的微生物基因信息，能够全面的分析样本内微生物的种类、丰度以及微生物的功能和代谢通路等信息，现在大量运用于动物胃肠道微生物多样性分析，研究宿主、微生物与生境因素之间的相互关系。但是依然存在一些不足，就环境样品微生物研究方面而言，基因组学的手段无法说明微生物基因的表达量情况，当生境或其他因素变化时，同一微生物个体的基因表达也会由于适应环境出现变化，需结合宏转录组学，从转录组水平分析样本微生物的组成及活性基因表达情况，揭示特定生境因素，特定时间下微生物基因表达和调控机制，并且更易发现新的基因，这些基因在某些特定环境条件下可能发挥很大作用。

参考文献：

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