转录组分析_转录组分析 | 使用Stringtie对数据进行下游处理

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接前文：

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我们接下来使用Stringtie对数据进行下游处理。

一.StringTie介绍

StringTie 是用于 RNA-seq 的转录本组装和定量软件，StringTie 可以看做是cufflinks软件的升级版本，其功能和Cufflinks是一样的，包括下面两个主要功能：转录本组装和定量；相比Cuffinks, 其运行速度更快。该软件的官网：https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml。

1、Stringtie通过使用genome指导的组装的方法与从头组装的概念结合的新方法来改善转录组组装。

 2、Stringtie的输入不仅可以是经过比对的结果，也可以是Stringtie通过从头组装read所得到的contig，当这两种输入都用到的时候，我们下面称之为stringtie+SR。

 3、对于很多使用参考基因组辅助组装的方法，组装的的策略都是先对read进行cluter，然后建立一个graph model来推测每个基因所有可能的isoform，最终通过不同的graph的解析方法得到对转录本的组装结果。

 4、有名的cufflinks用的是overlap graph，该模型中nodes代表fragment，如果两个fragment存在overlap并存在兼容的剪切模式，则对应的node连接起来。其解析方法为一种保守的算法，可以产生能够解释所有read的最少的转录本，尽管这种方法很吸引人，但是它没有考虑到转录本的丰度并且对于某些isoform来说该方法没有办法组装！

 5、stringtie采用了组装转录本和估计表达量同步进行的方法，这不同于cufflinks的先组装后定量的策略。

 6、首先，stringtie将read聚成cluster，然后采用了splice graph，其中node代表外显子或外显子的一部分，path将graph中可能 的剪切现象都连起来，最终对每个转录本通过创建一个网络流的方法，利用最大流算法(maximum flow algorithm)估计转录本的表达量。

 7、最大流的问题是最优理论中的经典问题，但是目前还没有应用到转录本定量中。

 8、与其它组装软件相比，stringtie具有很高的准确性和新型isoform的发现能力，其优势在于使用了网络流算法，同时stringtie也支持将read从头组装成更长的片段，这进一步提高了其组装的正确性。

 9、其另一个优势在于它的最优化策略，它平衡了每次组装中每条转录本的覆盖度，这样可以对组装算法产生一定的限制，因为在组装基因组时，覆盖度是很重要的一个参数因为它需要被用来限制算法，否则组装器可能将重复的片段错误地堆叠到一起，相似地转录组装也是如此，在isoform中的每一个外显子需要有相似的覆盖度，如果忽略这个参数可能会产生一些保守但是错误的转录本，其中含有大量剪切位点的基因组装起来尤其困难。

常用的参数及描述：

-o []<out.gtf>  #设置StringTie组装转录本的输出GTF文件的路径和文件名。此处可指定完整路径，在这种情况下，将根据需要创建目录。默认情况下，StringTie将GTF写入标准输出。-p <int>               #指定组装转录本的线程数(CPU)。默认值是1-G #使用参考注释基因文件指导组装过程，格式GTF/GFF3。输出文件中既包含已知表达的转录本，也包含新的转录本。选项-B，-b，-e，-C需要此选项(详情如下)-l