近10年,长非编码RNA(Long noncoding RNAs, lncRNA)的研究热度节节攀升。国自然项目中,lncRNA的中标项目数也不断增加,成为国自然数一数二的热点之一。如果你对2020年的国自然申请还没有方向,那么这个热点值得你考虑一下。
图1. 以lncRNA为关键词,lncRNA历年中标项目数
(来源: http://medsci.cn)
lncRNA,是指长度大于200核苷酸的非编码RNA。大量研究表明,lncRNA参与了从基因表达到蛋白质翻译和保持蛋白稳定等细胞机制,在发育、机体内平衡和维持细胞命运中发挥重要作用,lncRNA的异常表达与包括癌症和心血管疾病等多种疾病密切相关,因此提供了新的生物标志物和药物靶点。
图2. lncRNA参与基因表达调控,可以通过多种类型的lncRNA调控来调节基因表达
随着高通量测序、lncRNA芯片等技术的发展,越来越多的 lncRNA被鉴定出来,但具体的作用与功能仍然不是很清楚。通过不断发现新的lncRNA以及对已知lncRNA进行更彻底的表征研究可能会丰富lncRNA的分子机制及生物功能,因此 lncRNA依然具有极大的研究价值。
研究lncRNA的经典策略
1. 筛选lncRNA
通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对样本进行高通量筛选。
2. 表达分析
筛到表达差异最显著的lncRNA,通过qPCR或RNA原位杂交对候选lncRNA验证,检测lncRNA在不同细胞或者组织中的表达水平和定位。
3. 功能研究
研究基因功能的常规策略是用功能获得/缺失实验进行表型分析,通过细胞和动物实验进行验证。
4. 机制研究
lncRNA可与蛋白质、DNA和RNA相互作用,实现多样化功能。因此,可通过与其互作的分子探讨其功能与作用机制:
A. 与蛋白质相互作用:鉴定lncRNA的蛋白质伴侣可为其功能机制和途径提供线索。例如RNA免疫沉淀(RIP)技术与高通量测序结合使用,以鉴定与lncRNA相互作用的全部宿主蛋白质因子,尽管需要通过机理研究进一步验证。
B. 与DNA/RNA相互作用:已有多种技术被用来鉴定lncRNA靶向的基因组位点。基于染色质免疫沉淀(ChIP)和RIP的原理,染色质RNA免疫沉淀(ChRIP)可用于鉴定与特殊染色体标签相互作用的RNA。另一方面,可通过ChOP、ChIRP、CHART等技术使用标记的互补寡核苷酸来鉴定与目标RNA相互作用的DNA位点。
C. 结构特征:lncRNA可以形成特定的二级(碱基配对)和三级(三维)结构来执行其功能。可采用RNase footprinting,Chemical Mapping,in-line Probing和SHAPE (selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension)等技术研究其功能域。
图3. 研究lncRNA作用机制的方法
客户研究案例分析
原文标题:Lnc-mg is a long non-coding RNA that promotes myogenesis
期刊:Nature Communications
研究策略:
Step 1 lncRNA筛选
研究人员通过芯片筛选、不同的肌肉组织的表达鉴定以及mRNA的功能富集实验后,研究人员找到了与肌细胞生成相关的lncRNA,命名为lnc-mg。
图4. 芯片筛选肌生成相关的lncRNA以及验证
Step 2 lnc-mg功能分析
敲减和过表达(体外实验)
对lnc-mg进行敲减和过表达。结果显示,敲减后,MuSCs的分化受到抑制,其分子标志MyHC表达降低,肌小管数量减少;过表达后,MuSCs分化加强,肌小管数目增加。
图5. lnc-mg的敲减和过表达
体内实验
研究人员构建了lnc-mg敲除小鼠模型和转基因TG模型,分别检测腓肠肌(GAS),比目鱼肌(SOL),伸缩肌(EDL)和胫骨前肌的形状变化,检测发现lnc-mg敲除小鼠的肌肉重量变轻,体积变小,而TG小鼠的肌肉组织变重变大;此外,两种肌肉的僵直机能和运动能力也完全相反。这些体外和体内实验验证了lnc-mg是影响肌生成的重要lncRNA。
图6. lnc-mgskl -/-小鼠的形态学和功能变化
图7. lnc-mg转基因小鼠导致肌肉肥大
Step 3 lnc-mg机制研究
通过miRNA芯片筛选,从ceRNA角度进行验证。
通过芯片检测了过表达和敲减细胞的miRNA表达变化,发现miR-125b在过表达细胞中下调,在敲减细胞中上调。结合生物信息学结果分析得出:miR-125b是lnc-mg实现ceRNA机制的潜在靶点。此外,荧光素酶检测也证实了lnc-mg能结合miR-125b并影响其表达。
目前已有研究显示,miR-125b通过调控靶基因Igf2影响成肌细胞分化。因此,研究人员检测了过表达和敲减lnc-mg细胞中Igf2的表达,Western Blotting和ELISA结果表明Igf2蛋白表达分别增加和减少。进一步的荧光素酶和小鼠转基因模型实验也都清晰地表明,lnc-mg是通过竞争性地结合miR-125b影响Igf2的表达,从而影响肌细胞生成。因此,lnc-mg是通过典型的ceRNA机制影响肌生成。