和rna用什么鉴定_国自然基金中的研究热点——长链非编码RNA

近10年，长非编码RNA（Long noncoding RNAs, lncRNA）的研究热度节节攀升。国自然项目中，lncRNA的中标项目数也不断增加，成为国自然数一数二的热点之一。如果你对2020年的国自然申请还没有方向，那么这个热点值得你考虑一下。

图1. 以lncRNA为关键词，lncRNA历年中标项目数

（来源: http://medsci.cn）

lncRNA，是指长度大于200核苷酸的非编码RNA。大量研究表明，lncRNA参与了从基因表达到蛋白质翻译和保持蛋白稳定等细胞机制，在发育、机体内平衡和维持细胞命运中发挥重要作用，lncRNA的异常表达与包括癌症和心血管疾病等多种疾病密切相关，因此提供了新的生物标志物和药物靶点。

图2. lncRNA参与基因表达调控，可以通过多种类型的lncRNA调控来调节基因表达

随着高通量测序、lncRNA芯片等技术的发展，越来越多的 lncRNA被鉴定出来，但具体的作用与功能仍然不是很清楚。通过不断发现新的lncRNA以及对已知lncRNA进行更彻底的表征研究可能会丰富lncRNA的分子机制及生物功能，因此 lncRNA依然具有极大的研究价值。

研究lncRNA的经典策略

1. 筛选lncRNA

通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对样本进行高通量筛选。

2. 表达分析

筛到表达差异最显著的lncRNA，通过qPCR或RNA原位杂交对候选lncRNA验证，检测lncRNA在不同细胞或者组织中的表达水平和定位。

3. 功能研究

研究基因功能的常规策略是用功能获得/缺失实验进行表型分析，通过细胞和动物实验进行验证。

4. 机制研究

lncRNA可与蛋白质、DNA和RNA相互作用，实现多样化功能。因此，可通过与其互作的分子探讨其功能与作用机制：

A. 与蛋白质相互作用：鉴定lncRNA的蛋白质伴侣可为其功能机制和途径提供线索。例如RNA免疫沉淀（RIP）技术与高通量测序结合使用，以鉴定与lncRNA相互作用的全部宿主蛋白质因子，尽管需要通过机理研究进一步验证。

B. 与DNA/RNA相互作用：已有多种技术被用来鉴定lncRNA靶向的基因组位点。基于染色质免疫沉淀（ChIP）和RIP的原理，染色质RNA免疫沉淀（ChRIP）可用于鉴定与特殊染色体标签相互作用的RNA。另一方面，可通过ChOP、ChIRP、CHART等技术使用标记的互补寡核苷酸来鉴定与目标RNA相互作用的DNA位点。

C. 结构特征：lncRNA可以形成特定的二级（碱基配对）和三级（三维）结构来执行其功能。可采用RNase footprinting，Chemical Mapping，in-line Probing和SHAPE (selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension)等技术研究其功能域。

图3. 研究lncRNA作用机制的方法

客户研究案例分析

原文标题：Lnc-mg is a long non-coding RNA that promotes myogenesis

期刊：Nature Communications

研究策略：

Step 1 lncRNA筛选

研究人员通过芯片筛选、不同的肌肉组织的表达鉴定以及mRNA的功能富集实验后，研究人员找到了与肌细胞生成相关的lncRNA，命名为lnc-mg。

图4. 芯片筛选肌生成相关的lncRNA以及验证

Step 2 lnc-mg功能分析

敲减和过表达（体外实验）

对lnc-mg进行敲减和过表达。结果显示，敲减后，MuSCs的分化受到抑制，其分子标志MyHC表达降低，肌小管数量减少；过表达后，MuSCs分化加强，肌小管数目增加。

图5. lnc-mg的敲减和过表达

体内实验

研究人员构建了lnc-mg敲除小鼠模型和转基因TG模型，分别检测腓肠肌（GAS），比目鱼肌（SOL），伸缩肌（EDL）和胫骨前肌的形状变化，检测发现lnc-mg敲除小鼠的肌肉重量变轻，体积变小，而TG小鼠的肌肉组织变重变大；此外，两种肌肉的僵直机能和运动能力也完全相反。这些体外和体内实验验证了lnc-mg是影响肌生成的重要lncRNA。

图6. lnc-mgskl －/－小鼠的形态学和功能变化

图7. lnc-mg转基因小鼠导致肌肉肥大

Step 3 lnc-mg机制研究

通过miRNA芯片筛选，从ceRNA角度进行验证。

通过芯片检测了过表达和敲减细胞的miRNA表达变化，发现miR-125b在过表达细胞中下调，在敲减细胞中上调。结合生物信息学结果分析得出：miR-125b是lnc-mg实现ceRNA机制的潜在靶点。此外，荧光素酶检测也证实了lnc-mg能结合miR-125b并影响其表达。

目前已有研究显示，miR-125b通过调控靶基因Igf2影响成肌细胞分化。因此，研究人员检测了过表达和敲减lnc-mg细胞中Igf2的表达，Western Blotting和ELISA结果表明Igf2蛋白表达分别增加和减少。进一步的荧光素酶和小鼠转基因模型实验也都清晰地表明，lnc-mg是通过竞争性地结合miR-125b影响Igf2的表达，从而影响肌细胞生成。因此，lnc-mg是通过典型的ceRNA机制影响肌生成。