说在前面
这篇文章虽然期刊分数不高，但是是一篇很典型的单细胞联合bulk+空转的免疫预后模型文章，也算是筛选生物标志物的套路了，适合新手学习和模仿研究思路～
其实故事新颖一点，再润一下色是可以投更高分的
今天给大家分享的一篇文章：Targeting nucleotide metabolic pathways in colorectal cancer by integrating scRNA-seq, spatial transcriptome, and bulk RNA-seq data
- 标题：通过整合 scRNA-seq、空间转录组和大量 RNA-seq 数据靶向结直肠癌中的核苷酸代谢通路
- 期刊名称：Functional & Integrative Genomics
- 影响因子：2.9
- JCR分区：Q2
- 中科院分区：生物学4区
- 小类：遗传学4区
摘要
背景
结直肠癌是消化系统的恶性肿瘤，起源于结肠或直肠的异常细胞增殖，通常导致胃肠症状和严重的健康问题。核苷酸代谢涉及DNA和RNA的合成，是一种关键的细胞生化过程，对结直肠癌的进展和治疗策略有重要影响。
方法
在单细胞RNA测序（scRNA-seq）中，采用了五种功能计算与核苷酸代谢相关的分数。利用细胞发育轨迹分析和细胞间互作分析探索不同上皮细胞的代谢特征和通信模式。通过空间转录组RNA测序（stRNA-seq）进一步验证这些发现。利用来自TCGA和GEO队列的表达谱数据构建风险模型，以优化临床决策。通过体外实验进一步功能验证关键的核苷酸代谢相关基因（NMRGs）。
结果
在scRNA-seq和stRNA-seq中，结直肠癌（CRC）显示出独特的细胞异质性，肿瘤样本中的髓系细胞和上皮细胞表现出更高的核苷酸代谢分数。细胞间通信分析显示，具有高核苷酸代谢的上皮细胞与成纤维细胞之间的信号通路和配体-受体相互作用增强。空间转录组测序证实肿瘤组织核心区的核苷酸代谢状态升高。在识别上皮细胞中差异表达的NMRGs后，一个基于四个基因的风险预后模型有效预测了患者的总生存率和免疫治疗结果。高风险组患者表现出免疫抑制的微环境，以及相对较差的化疗和免疫治疗反应。最后，基于数据分析和一系列细胞功能实验，确定ACOX1和CPT2为CRC的新的治疗靶标。
结论
本研究通过结合单细胞测序、空间转录组测序和高通量数据，对CRC中的NMRGs进行了全面分析。以NMRGs构建的预后模型展示了作为结直肠癌患者独立预后标志的潜力，并可能显著影响CRC个性化治疗方法的发展。
补充信息
在线版本包含补充材料，可在 10.1007/s10142-024-01356-5查看。
关键词：核苷酸代谢，结直肠癌，单细胞RNA测序，空间转录组RNA测序，预后模型，免疫治疗。
结果
图1
结直肠癌细胞亚群分类及与核苷酸代谢相关的基因表达得分。
- (A-D) t-SNE图显示了不同样本、组织来源、细胞簇和细胞亚群，颜色编码以增加清晰度。
- (E) 热图展示了八个不同细胞亚群内标记基因的相对表达情况。高表达的基因用红色表示，低表达的基因用蓝色表示。
- (F) 直方图显示了不同样本中细胞类型的分布。
- (G) 展示了这些细胞亚群中常用标记基因的表达模式。
- (H) 气泡图展示了结直肠癌中不同细胞类型的核苷酸代谢相关基因的富集得分。
- (I) t-SNE图表明了每个细胞类型核苷酸代谢相关基因的富集得分，较深的绿色表示得分更高。
- (J) 结直肠癌与正常组织中每个细胞类型核苷酸代谢相关基因富集得分的差异。
图2
细胞发育轨迹分析和细胞通讯分析。
- (A) 恶性细胞的细胞轨迹和伪时间分析。
- (B) 热图展示了与核苷酸代谢相关的40个基因在细胞发育过程中表达差异的模式。低表达用蓝色表示，高表达用红色表示。
- © 气泡图展示了不同细胞类型间信号通路活性分析。
- (D) 圆形图可视化了不同细胞类型之间配体-受体相互作用的强度。
- (E) 鉴定上皮细胞和成纤维细胞之间排名靠前的配体-受体对及其相关转录因子。
- (F) 不同细胞类型间配体-受体相互作用强度的评估。
图3
结直肠癌空间转录组中核苷酸代谢的表征。
- (A) 空间表示展示了通过stRNA-seq鉴定的14个簇。
- (B) 气泡图展示了不同簇内与核苷酸代谢相关基因的表达水平。红色表示高表达，蓝色表示低表达。
- © 气泡图呈现了不同簇间的代谢强度。
- (D) 显示嘧啶代谢强度的空间描述。
- (E) 显示嘌呤代谢强度的空间可视化。
- (F) 使用Python鉴定的11个细胞簇的空间表示。
- (G) 空间地图展示了簇1至8的发育轨迹。
- (H) 使用RCTD算法识别CRC空间地图中不同细胞类型的主要分布。
- (I) 基于MISTy的不同细胞类型的空间聚类外推。
- (J) 基于MISTy的不同细胞类型之间的空间相关性投影。
图4
核苷酸代谢相关风险评分计算及预后模型开发。
- (A) 通过单变量Cox分析确定的五个预后基因的森林图。
- (B) LASSO系数的剖面图。
- © 在LASSO模型中选择调参参数的十折交叉验证。
- (D) 多变量Cox分析结果，包括模型基因及其对应的系数。
- (E-H) TCGA队列、完整GEO队列、GSE17538队列和GSE39582队列中将患者分为低风险组和高风险组的Kaplan-Meier生存曲线。
- (I) TCGA队列中1、3和5年风险评分的曲线下面积（AUC）值。
- (J-L) TCGA队列、GSE17538队列和GSE39582队列中低风险组和高风险组得分分布，以及患者生存数据。
图5
TCGA队列中风险评分和临床病理因素的独立预后分析。
- (A, B) TCGA训练队列中针对总生存期（OS）的临床病理变量和风险评分的单变量和多变量Cox回归分析。
- © 集成的预测模型，结合年龄、等级和分期预测结直肠癌患者1、3和5年的OS。
- (D) 预测模型的校准曲线。
- (E) TCGA队列中3年风险评分和临床特征的曲线下面积（AUC）值。
- (F) 决策曲线分析（DCA）曲线，包括风险评分、预测模型得分和其他临床特征。
- (G) 使用C指数评估不同临床特征、预测模型得分和风险评分的预测性能。
- (H) 热图显示了通过卡方检验确定的与亚组相关的四个模型基因和临床特征的表达谱。
- (I) 各种得分亚组中的临床分期分布。
图6
结直肠癌样本中的突变景观和微卫星不稳定性。
- (A) 对542个结直肠癌样本的突变景观进行概述。
- (B) 突变类型的详细分类，其中最常见的是错义突变。单核苷酸多态性（SNP）构成了大多数突变，其中C>T突变最常见。水平柱状图展示了结直肠癌中前10个发生最多突变的基因。
- © 不同风险亚组中具有最高突变频率的20个基因的突变状态和肿瘤突变负荷（TMB）情况。
- (D) 不同亚组间TMB的比较。
- (E) 风险评分和TMB之间的相关性分析。
- (F) 四个亚组之间的生存差异：H-TMB+高风险评分、H-TMB+低风险评分、L-TMB+高风险评分和L-TMB+低风险评分。
- (G) 基于微卫星不稳定性对三个亚组中结直肠癌患者的风险评分差异进行比较：微卫星高度不稳定（MSI-H）、微卫星低度不稳定（MSI-L）和微卫星稳定（MSS）。
- (H) 高风险组和低风险组患者的MSI分类百分比。
图7
对TCGA队列不同风险评分亚组中免疫微环境和免疫相关功能的分析。
- (A) 利用七种不同算法评估风险评分亚组间免疫浸润的变化。
- (B) 对通过ESTIMATE计算的免疫分数和基质分数在不同风险评分亚组间的差异进行评估。
- © 检查不同风险评分亚组内免疫检查点表达的变化。
- (D) 热图展示不同风险评分亚组之间肿瘤微环境（TME）得分、免疫检查点表达和免疫细胞浸润的差异。
- (E) 雷达图描述了不同风险组患者中免疫细胞浸润和免疫相关通路的变化，通过ssGSEA进行评估。
- (F) 癌症RNA干细胞特性得分（RNAss）与风险评分之间的相关性分析。
图8
TCGA队列中不同风险评分组的生物学特性。
- (A) 基于MsigDB的GSVA分析描述了两个核苷酸代谢相关评分组的生物学特性。
- (B) 基于Metascape的富集分析揭示了两个风险评分组间差异表达基因的富集情况。
- © GO和Reactome术语的t-SNE图描述了两个风险评分组中核苷酸代谢途径活性的差异。
- (D) 风险签名的GO和KEGG术语的GSEA分析结果。
Fig. 9
免疫治疗和化疗效果的预测。
- (A) 高风险评分组和低风险评分组免疫评分（IPS）相对分布的比较。
- (B) 风险评分、ICB反应特征和肿瘤-免疫周期各阶段之间的关系。
- © 建模基因-免疫基因相关性的热图。
- (D) 高风险评分组和低风险评分组结直肠癌患者TIDE的差异。
- (E) 风险评分与顺铂、伊马替尼和阿霉素的IC50值之间的相关性。
Fig. 10
ACOX1和CPT2是结直肠癌患者的保护基因。
- (A) 展示了结直肠癌中ACOX1的表达的空间地图。
- (B) ACOX1+上皮细胞高和低表达组患者的OS的Kaplan-Meier生存曲线。ACOX1+上皮细胞在产生不同免疫反应的患者中的比例。
- © 通过反卷积算法获得的不同细胞类型的空间地图。包括ACOX1表达阳性和表达阴性的上皮细胞、内皮细胞、髓样细胞、肥大细胞、成纤维细胞和T/NK细胞。
- (D, E) 根据stlearn方法预测不同细胞类型之间通讯强度的热图和网络图。
- (F) 展示了结直肠癌中CPT2的表达的空间地图。(G) CPT2+上皮细胞高和低表达组患者的OS的Kaplan-Meier生存曲线。CPT2+上皮细胞在产生不同免疫反应的患者中的比例。(H) 通过反卷积算法获得的不同细胞类型的空间地图。包括CPT2表达阳性和表达阴性的上皮细胞、成纤维细胞、T/NK细胞、内皮细胞、髓样细胞和B细胞。(I, J) 根据stlearn方法推断不同细胞类型之间通讯强度的热图和网络图。
Fig. 11
ACOX1和CPT2在结直肠癌中的表达。
- (A) 免疫组织化学染色结果显示了结直肠癌组织中ACOX1和CPT2的蛋白表达水平。
- (B) 与人类肠上皮细胞NCM细胞系相比，结直肠癌细胞系中ACOX1和CPT2的表达水平较低。
- © 使用si-RNA或阴性对照（NC）转染的结直肠癌细胞中检测到ACOX1和CPT2的相对表达水平，采用RT-qPCR进行检测。
Fig. 12
ACOX1和CPT2在结直肠癌中的功能实验。
- (A) 转移实验显示，降低ACOX1和CPT2表达促进了结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。
- (B) CCK8实验显示，相比于NC组，降低ACOX1和CPT2表达的结直肠癌细胞的增殖能力显著增强。ns，不显著；* p< 0.05；** p< 0.01；*** p< 0.001；**** P< 0.0001
小结
- 主要数据及方法：
| Types | Notes |
|---|---|
| 分析数据 | BulkRNA：TCGA-COADREAD、GSE39582、GSE17538；scRNA：GSE166555；stRNA：OEP001756；核苷酸代谢基因集：GeneCard |
| 分析方法 | 单细胞标准流程；基因集评分；Monocle拟时序分析；预后评分模型；突变分析+瀑布图；免疫浸润评分；免疫治疗和化疗的预测 |
| 实验技术 | ACOX1 和 CPT2 的细胞培养和敲低；免疫组化验证 |
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