DSP(Digital Spatial Profiler)技术在神经内分泌肿瘤方面的运用

hello，今天我们要继续分享关于DSP空间转录组技术的运用，参考文献在Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient,分享的主要目的是在于分析DSP对于肿瘤空间异质性的研究。

Abstract

内在的肿瘤内异质性 (ITH) 与较差的患者预后有关。spatial profiling technology的发展使得通过multiple analysis readouts破译 ITH 成为可能。晚期卵巢透明细胞癌 (OCCC)，已知含有 ITH，具有化学抗性，预后差，并具有独特的分子和组织学特征。然而，OCCC 内 ITH 性质的详细空间信息仍不清楚。在这里，利用 NanoString 数字空间分析 (DSP) GeoMx 平台对来自一名晚期 OCCC 患者的原发和结肠转移部位的肿瘤样本进行多重蛋白质表达分析。空间分辨率显示转移性肿瘤内存在上皮间充质 (EM) 梯度，但原发肿瘤不存在，并且在原发肿瘤内未观察到类似的 EM 梯度。 EM 梯度表现出从转移性肿瘤的外围到核心的不同模式。与原发部位的肿瘤细胞相比，结肠转移瘤的肿瘤外围和肿瘤核心之间存在中间区，具有泛细胞角蛋白（PanCK）、纤连蛋白（FN）、平滑肌肌动蛋白（SMA）的差异表达模式、神经细胞粘附分子（NCAM）、整合素αX（ITGAX）和Ki-67。课题的研究提供了第一个空间分辨的原位证据，证明了相似形态的肿瘤样本中的中间或混合 EM 状态。这不仅证明了空间分析在精准医学中的有前景的应用，而且还提供了前所未有的癌症进展过程中 EM 梯度的view，例如 OCCC。

Introduction

肿瘤内异质性 (ITH) 表现为基因和分子多样性的肿瘤细胞与肿瘤微环境 (TME) 中周围免疫细胞和基质细胞的各种组成混合，对于确定治疗反应和患者结果至关重要。 随着具有高维复用能力和单细胞分辨率的技术平台的发展，ITH的revelation更加清晰。 但是单细胞测序等方法失去了空间背景，使得解释 ITH 的邻域效应变得困难。
Nanostring Digital spatial profiling (DSP) 保留了空间信息，并允许对组织的micro-niche compartments中的细胞异质性进行多组学分析。 DSP 的优势在于蛋白质和 RNA 的multiplex readouts、定义的感兴趣区域 (ROI)，以及在保留空间信息的同时在新鲜冷冻或 FFPE 组织中profile these analytes的能力。 简而言之，DSP如何工作的概念就像具有先进复用技术的IHC或ISH。 样品deparaffinized and rehydrated，将进行抗原或靶标修复步骤，然后将样品与可视化标记 (VM) 和通过光可切割接头连接寡核苷酸的探针的混合物一起孵育，用于检测感兴趣的目标。 一旦样本被 DSP 完全扫描，就可以选择感兴趣的区域 (ROI) 并使用各种分析模式定义区域 (AOI) 的标准，包括几何形状、荧光信号、稀有细胞分析、轮廓和网格分割方法。

 

然后 DSP 机器将紫外光投射到这些明确定义的 AOI 上，释放的寡核苷酸将被微毛细管系统收集。 收集到寡核苷酸后，将它们分配到微量滴定板中，并通过 nCounter 系统或 NGS readout进行计数分析。通过结合荧光 VM、独特的寡核苷酸连接探针和寡核苷酸条形码系统，DSP 实现了保留样本空间信息和同时获取multiplex readouts的目标。
在约占卵巢癌 90% 的上皮性卵巢癌 (EOC) 的所有亚型中，晚期卵巢透明细胞癌 (OCCC) 因其相对较差的预后、较差的结果以及对标准铂类药物的敏感性较低而广为人知。 这与 OCCC 肿瘤的分子和遗传异质性有关； 然而，尚未以高空间分辨率报告 OCCC 中 ITH 的详细信息。 进一步了解导致其侵袭性的机制和分子事件是开发更合适的 OCCC 治疗的关键。这篇文章的研究中，报告了来自晚期 OCCC 患者的原发性和转移性肿瘤样本的首次空间分析研究的工作流程。 分析的结果揭示了上皮样和间充质样特征分布的空间相关梯度，这在转移部位而不是原发部位观察到，表明肿瘤进展过程中的克隆多样性。

Results

DSP Workflow

包括来自患者的卵巢原发部位（标记为 Pri）和结肠转移部位（标记为 Met）样本的archival FFPE sections。

based on referencing the H&E staining morphology and fluorescence signals side-by-side分割所有 ROI。 用于区分 OCCC 肿瘤细胞和免疫细胞的可视化标记 (VM) 包括核染色 Syto13 和针对 PanCK（一种肿瘤细胞标记）和 CD45（一种泛免疫细胞标记）的荧光团偶联抗体。 同时，利用 18 重纳米线免疫细胞分析核心来反映蛋白质表达水平。 ROI 被细分为 PanCK 阳性片段和 CD45 阳性片段作为 AOI。 对于Pri，收集了19个PanCK阳性片段和15个CD45阳性片段并通过了QC； 对于 Met，收集了 21 个 PanCK 阳性片段和 2 个 CD45 阳性片段并通过了 QC。

Heterogeneity of PanCK-positive segments showed EM gradients in the metastatic tumor

The 57 segments were categorized into 2 clade and 5 subclusters

• 注：Unsupervised hierarchical clustering of the 18-plex protein expression data of PanCK-positive segments (grass green squares) and CD45-positive segments (orange squares) among all analyzed AOIs in the primary (light yellow) and metastasis (pale blue) tumors. Subclusters in colored squares from left to right: C1_CD45+ cell_Antigen presenting (dark red), C1_CD45+ cell_CD8high (pale orange), C1_tumor_Ki-67high (red), C1_tumor_Ki-67low (yellow), and C2_tumor (blue).

代表肿瘤细胞的 PanCK 阳性片段可分为 2 个cluster：C1_tumor 和 C2_tumor。 这两个cluster显示出 PanCK 和 beta-2-微球蛋白 (B2M) 的矛盾表达模式。 对于 C1_tumor 中的 PanCK 阳性片段，观察到低 PanCK 和高 B2M； 对于 C2_tumor 中的那些，观察到高 PanCK 和低 B2M。 C1_tumor中除ROI 006外的所有PanCK阳性片段均来自Met，而C2_tumor中64.3%的PanCK阳性片段来自Pri。 相比之下，Met 中 52.4% 的 PanCK 阳性片段属于 C1_tumor，而其他 47.6% 属于 C2_tumor（通过卡方检验 p=0.00371).
与 Met 中的那些相比，Pri 中大多数 PanCK 阳性片段中的肿瘤细胞相对更像上皮细胞和同质性。 Pri 内几乎所有 PanCK 阳性片段都属于 C2_tumor。 在这些 PanCK 阳性片段中观察到高度同质性，未观察到 Pri 肿瘤细胞的某些分布模式.

• 注：Outline of Pri morphology and selected ROIs

数据进一步表明，与 Pri 肿瘤细胞相比，Met 内的肿瘤细胞上皮较少，异质性更强，PanCK 表达较低，SMA 表达较高。 Met PanCK 阳性片段属于两个不同的进化枝：C1_tumor 和 C2_tumor_Met。 与C2_tumor_Met相比，C1_tumor中的肿瘤细胞通常表达较低水平的PanCK和较高水平的FN、B2M、HLADR、CD4和CD56，tumor cells in C1_tumor could be further subdivided into C1_tumor_Ki-67high and C1_tumor_Ki-67low based on the expression level of Ki-67。C1_tumor_Ki-67high中的肿瘤细胞在Ki-67中相对较高，而C1_tumor_Ki-67low中的肿瘤细胞在Ki-67中较低。解剖不同cluster内这些片段之间的空间关系，我们发现C2_tumor_Met的PanCK阳性片段位于Met的外围区域，C1_tumor_Ki-67high的片段位于肿瘤中心，C1_tumor_Ki-67low的片段位于两者之间 .

• 注：Outline of Met morphology and selected ROIs. Numeric labels of the ROI identity with corresponding colors indicate the subclusters of PanCK-positive segments. For CD45-positive segments within each ROI, additional text labels with corresponding colors were indicated next to the outline of ROIs. Scale bars indicate 2000 μm

这种空间分布模式对应于不同的混合 EM（上皮间充质）状态。 从 C1_tumor_Ki-67high（肿瘤中心）、C1_tumor_Ki-67low（中间区域）到 C2_tumor_Met（肿瘤外围），PanCK 表达水平的增加伴随着 FN 和 CD56 (NCAM) 表达水平的降低，表明存在 EM 梯度。 因此，根据 EM Spectrum(Guidelines and definitions for research on epithelial–mesenchymal transition)的概念，将 C2_tumor_Met、C1_tumor_Ki-67low 和 C1_tumor_Ki-67high 粗略地分为早期混合 E、早期混合 M 和晚期混合 M。 有趣的是，与 C2_tumor_Met 和 C1_tumor_Ki-67high 中的肿瘤细胞相比，C1_tumor_Ki-67low 中的肿瘤细胞表达较低的 Ki-67 和较高的 CD11c (ITGAX)。 在 Pri 中未观察到类似的 EM 梯度。

• 注：Box plots depicting the expression patterns of PanCK, SMA, Ki-67, FN, NCAM, and ITGAX between AOIs belonging to the C1_tumor_Ki-67high (red), C1_tumor_Ki-67low (yellow), and C2_tumor_Met (blue) subclusters in Met. Y-axis: numeric values of normalized protein expression level (extracted from the heatmap). One-way ANOVA, *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001.

进一步对 Met 内的 PanCK 阳性片段进行了geospatial analysis分析，以检查这些标志物表达的变化是否与这些区域和肿瘤核心之间的距离呈线性相关。 结果表明，PanCK和SMA的表达水平与到核心的距离呈显着正相关； 同时，FN和NCAM的表达水平与到核心的距离呈显着负相关。 此外，还发现了其他 4 个标记，它们的表达与到核心的距离之间具有线性相关性。 这 4 个标记包括 GZMB、B2M、CD3 和 CD4。 其中，GZMB 与核心距离呈正相关，而在 B2M、CD3 和 CD4 上观察到相反的情况。 geospatial analysis进一步证实了 Met 肿瘤样本内的 EM 梯度，在 PanCK、SMA 和 FN、NCAM 之间具有显着的反相关性。

• 注：Scatter plots depicting the changes in the expression levels of PanCK, SMA, FN (Fibronectin),NCAM (CD56), GZMB, B2M (Beta_2_microglobin), CD3, and CD4 between PanCK-positive AOIs of Met. The color of each point indicates the numeric values of normalized protein expression level (extracted from the heatmap). X-axis: x coordinate of the center of each ROI. Yaxis: y coordinate of the center of each ROI.

Heterogeneity of CD45-positive segments

一般而言，Pri 和 Met 中的 CD45 阳性片段可通过 B2M、HLADR、CD4 和 CD56 的表达细分为两个cluster，C1_CD45+ cell_Antigen presenting和 C1_CD45+ cell_CD8high。 C1_CD45+cell_CD8high，四个免疫相关标志物表达相对较低的cluster，表现出比C1_CD45+细胞_抗原呈递更强的CD8信号。 在这两个 CD45 阳性cluster内没有观察到特定的空间分布模式，表明肿瘤不同区域的免疫细胞组成不同。

Discussion

OCCC 已显示出基于基因表达谱的上皮 (E) 和间充质 (M) 亚型。 然而，目前尚不清楚在 OCCC 中是否存在这些 EM 基因表达亚型的内在 ITH。 在这项研究中，发现显示为梯度的 EM 异质性仅存在于转移性而非原发性 OCCC 肿瘤中。 分析推测在这些肿瘤细胞亚群中观察到的这些分子变化和不同的 EM 状态可能是由于肿瘤中的缺氧所致。
人们普遍认为，恶性细胞的异常结构限制了实体瘤中氧的扩散效率，阻碍了氧的输送，从而使氧分压显得相对较低甚至降至零。 据报道，肿瘤缺氧与癌症的几个方面相关，例如较差的结果、血管生成、转移、遗传不稳定性、肿瘤微环境、纤连蛋白和 EMT 的调节。 事实上，已证明 HIF-1α 的核表达在 OCCC 中的表达水平明显高于其他组织学类型 (PMID: 17532031)。在头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 中，部分 EMT (p-EMT) 程序已被证明与肿瘤前沿 HNSCC 的 ITH 基础的缺氧程序密切相关 (PMID:29198524)。 在研究中，推测肿瘤中心相对较低的氧分压会导致环境压力并在肿瘤中心附近的肿瘤细胞（C1_tumor_Ki-67high & C1_tumor_Ki-67low）中引发缺氧诱导的 EMT，这使得它们比比肿瘤的外围区域 (C2_tumor_Met)更像间充质比肿瘤的外围区域 (C2_tumor_Met)。 C1_tumor_Ki-67high 和 C1_tumor_Ki-67low 中的高 FN 和 NCAM 表达可以进一步支持这种推测。 研究表明，缺氧可能导致 FN 的内源性上调，这可能导致细胞运动增加和整合素相关信号通路的激活，而 OCCC 相对较差的结果已经与由于 p53 功能丧失而导致 FN 的更高表达有关。 同时，NCAM 已被证明与上皮性卵巢癌的迁移和侵袭有关，这加强了观察到的 C1_tumor_Ki-67high 和 C1_tumor_Ki-67low 中 NCAM 表达升高与其间充质样特性之间的联系。 这些研究表明 FN 和 NCAM 在破译转移肿瘤中肿瘤细胞的性质方面的重要性。
有趣的是，C1_tumor_Ki-67low 肿瘤细胞中 ITGAX 的上调和 Ki-67 的下调可能反映了它们的侵袭性。 尽管长期以来被认为是树突状细胞标志物，但据报道上调的 ITGAX 与乳腺癌和前列腺癌的侵袭性相关。 由于ITGAX是属于整合素家族的细胞粘附受体分子，分析推测其上调可能涉及细胞迁移中FN-整合素信号通路的激活。 同时，相对较低的 Ki-67 可能表明 C1_tumor_Ki-67low 中的肿瘤细胞处于静止状态。 Ki-67已被公认为细胞增殖标志物，Ki-67低表达的细胞被认为是生长缓慢的细胞或处于G0的细胞 。肿瘤细胞以缓慢的增殖速度进入间充质样状态可能是逃避apoptotic and anoikis的一种可能机制。 此外，低扩散率可能与迁移和扩散之间的权衡有关。 先前的研究表明，与具有其他 EMT 表型的卵巢癌细胞相比，处于中间间充质状态的卵巢癌细胞具有更强的anoikisresistant和侵袭性。 总的来说，处于early-hybrid M 状态的 C1_tumor_Ki-67low 中的肿瘤细胞具有一些对抗环境压力的有益特征。
EMT 被认为有助于癌症进展。 然而，从临床病理学的角度来看，EMT 的变化通常无法通过常规组织病理学检查在视觉上辨别出来。 原因是 EMT 通常只发生在选定的肿瘤细胞群中，要么位于侵袭前沿，要么靠近缺氧区域。 此外，临床病理学环境中的 EMT 检测方法尚未最佳建立。 虽然已经提出了各种 EMT 评分方案，但这些方案均未达到临床应用。研究显著反映了肿瘤异质性的性质，该研究说明了在转移瘤中观察到的 EM 梯度的空间分布，而不是原发肿瘤。 这突出了传统方法无法解决的肿瘤间和肿瘤内异质性。 DSP 等技术的可用性使检测存在于形态相似肿瘤区域中的局部 EMT 变化成为可能。 这开辟了一条探索患者样本中 EMT 谱的新途径。
尽管 DSP 是进一步研究 ROI 中细胞分子表达的强大工具，但据报道，检测和测量受标记物的丰度和检测顺序的影响，这可能是由于顺序寡核苷酸收集步骤和固有的 10 μm 分辨率限制。 根据现有的经验，观察到某些 ROI 中的红细胞（直径 < 10 μm）会在分割步骤中被错误标记为目标细胞，例如 CD45 阳性细胞，this could cause bias in data interpretation because of the interference of collected oligos from those erythrocytes.这可以通过在进行分割时提高 DNA 通道信号的阈值或不选择富含红细胞的区域作为 ROIs 来防止，但如果样本来自肿瘤切片，例如来自出血的样本，则干扰有时是不可避免的，这会导致红细胞overwhelm感兴趣区域的肿瘤细胞。 另一个限制是 DSP 目前对整个组织切片进行分析是不切实际的。 例如，与 CODEX 相比，DSP 依赖于检测几个选定的小 ROI（最大 ROI 直径约为 760 μm）来获取用于进行进一步探索的数据。 可以想象，对整个样本进行检查将非常耗时且成本高昂。 因此，事先调查、适当的研究设计和良好的研究问题对于充分利用这个高通量多重平台的力量是必不可少的。

Method

ROI selection, collection, and analysis

Stained sections were loaded onto GeoMx DSP followed by the selection of region of interests (ROIs). All the OCCC samples in the study were annotated by a pathologist (W.C. Lin) on the H&E slides. ROIs selection was based on annotation of their respective H&E slides. The ROI size ranged from 200 μm to 700 μm in diameter, and 18 to 19 ROIs were selected per sample. ROIs can be compartmentalized into tumor or immune-related cell segments. Once ROIs and segments were confirmed, UV-light were projected onto each defined segment. UV photocleavable oligonucleotide barcodes were released, collected by microcapillaries, and dispensed into different wells of a microtiter plate, respectively. The collected oligonucleotide barcodes were then pooled and hybridized at 67∘C for at least 16 hours before loading onto nCounter Flex system.

Distance to core analysis（重点）

Euclidean distance to the Met core was computed using Matlab® R2016b version 9.1.0.960167 (MathWorks; Natick, MA, USA) pdist2 function using the x- and y-coordinates of the ROIs. We estimated the core of Met from the x- and y-coordinates average from the 4 ROIs of the core.

Data normalization and visualization

The readouts from nCounter (version 4.0.0.3) were transferred to GeoMx, QC and normalization using the built-in data analysis software (version 2.1.0.33). The raw data were first normalized to ERCC (External RNA Control Consortium) spike-in controls. Subsequently, the spike-in normalized data were scaled by geometric mean of nuclei counts, and by geometric mean of Rb IgG. The normalized data were log-transformed, and genes, arrays were mean-centered by Cluster 3.0. Clustering was also performed using Cluster 3.0 using similarity metric of Pearson correlation, and tree-construction method of centroid linkage. The heatmap of the clustered data was generated with Java Treeview (version 1.1.6r4). The normalized data were extracted and made into box plots and scatter plots. The data of x coordinate and y coordinate utilized to build the scatter plots were extracted from DSP. The scatter plots were created in R using ggplot2 package. Statistical significance of association was assessed using Chi-square test whereas mean difference was assessed using Anova test.

生活很好，有你更好