10X单细胞空间（RNA、ATAC、Spatial）联合分析剖析类风湿关节炎中炎症相关滑膜成纤维细胞的异质性及其驱动因素

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又是周五，一周又将过去，时间总是匆匆，半刻不会停留，很想挽留，但是却没有方法，很多时候不希望时间就这么悄悄溜走，只好在时间的道路留下一些标记，回头看时，知道自己曾经来过

今天又是单细胞空间占据身心的一天，分享的文献在Heterogeneity of Inflammation-associated Synovial Fibroblasts in Rheumatoid Arthritis and Its Drivers，单细胞空间目前还是科服，临床的道路，还是太远。

总结一下小知识

白细胞介素即是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。目前至少发现了38个白细胞介素，分别命名为IL-1~IL38，功能复杂，成网络，复杂重叠；在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。
趋化因子家族：趋化因子与具有7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体结合，启动G蛋白亚单位α和βγ的解离，随后启动丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）和磷脂酶C（PLC）活化途径和细胞内钙水平的增加，最终驱动细胞极化、粘附和迁移。趋化因子受体是视紫红质家族细胞表面G蛋白偶联受体的一大分支。下图显示了各趋化因子及其受体，以及表达这些受体的细胞类型。大家可以参考文章趋化因子Chemokines家族

细胞间黏附分子，细胞粘附分子(CAM)是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质(ECM)间相互接触和结合分子的统称。粘附分子以受体-配体结合的形式发挥作用，使细胞与细胞间，细胞与基质间，或细胞-基质-细胞间发生粘附，参与细胞的识别，细胞的活化和信号转导，细胞的增殖与分化，细胞的伸展与移动，是免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理和病理过程的分子基础。

Abstract

非屏障免疫静止组织的炎症与血源性先天性和适应性免疫细胞的大量流入有关。来自后者的线索可能会改变和扩大在组成型驻留细胞中观察到的状态范围。然而，人类炎症性疾病中 immigrant 和常驻细胞类型之间的局部通信仍然知之甚少。在这里，使用配对的单细胞 RNA 和 ATAC 测序 (scRNA/ATAC-seq)、多重成像和空间转录组学以及细胞的体外建模来探索类风湿性关节炎 (RA) 患者发炎关节中滑膜成纤维细胞 (FLS) 的异质性外在因素信号。这些分析表明，局部暴露于骨髓和 T 细胞衍生的细胞因子、TNFα、IFNγ、IL-1β 或缺乏会导致六种不同的 FLS 状态，其中一些与其他受疾病影响的组织（包括皮肤和结肠）中的成纤维细胞状态非常相似。研究的结果强调了在发炎的滑膜内同时发生的、空间分布的细胞因子信号传导的作用。

Introduction

类风湿性关节炎 (RA) 是一种以关节表现为主的全身性自身免疫性疾病，其特征在于与滑膜下层和充满滑液的关节间隙相接的滑膜层增生，以及表现出血管化增加的滑膜下层和大量白细胞的涌入。Both the lining and sublining 成纤维细胞样滑膜细胞 (FLS) 都经历增殖和激活，假设它们刺激血管生成，产生促炎细胞因子和趋化因子，并侵入邻近的关节软骨和骨骼。活化的 FLS 对 MHC II 类分子的表达与滑膜炎症相关，它们通过 lining FLS 的表达与活动性疾病相关。HLA-DR+ FLS expression of soluble mediators, including the proinflammatory cytokines IL-6 and IL-15, and chemokines CCL2, CXCL9, and CXCL12 along with adhesion molecules such as ICAM1 and VCAM1 suggests that these features of FLS might be imparted by their interactions with leukocytes。为了支持这种可能性，之前的体外研究表明 HLA-DR+ FLS 能够将抗原呈递给 CD4+ T 细胞。此外，FLS 产生上述促炎趋化因子可能作为一种前馈机制，进一步促进表达相应受体的不同免疫细胞类型的募集。事实上，最近一项使用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 分析对 RA 患者滑膜组织整体细胞组成的研究确定了造血和非造血来源的迁移和驻留细胞类型的多样化组合，包括不同的 CD4 和 CD8 T细胞亚群、骨髓细胞和 FLS。这些观察结果表明，FLS 的激活和分化状态可能受到在 RA 患者发炎关节中发现的多种先天性和适应性免疫细胞类型的调节，并且这种调节因素在疾病发病机制中是显著的。

因此，试图对发炎的 RA 滑膜中诱导的 FLS 状态谱以及通过配对 scRNA 和测序分析转座酶可接近染色质 (scRNA/ATAC-seq) 观察到的 FLS 异质性的潜在驱动因素进行深入研究以及对关键免疫细胞衍生的促炎细胞因子的 FLS 转录反应的体外建模。然后，通过使用空间转录组 (ST) 分析以及多重成像来绘制 FLS 异质性和转录反应的空间分布。研究表明，空间受限的 FLS 对三种主要的白细胞衍生细胞因子 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 的反应或缺乏反应，驱动了与 RA 滑膜炎症相关的六种不同 FLS 状态的形成。

Result

Inflammation is associated with heightened FLS heterogeneity

为了测试 RA 患者的严重关节炎症导致 FLS 异质性显著扩大的可能性，分析试图以单细胞分辨率表征它们的转录组和染色质可及性。荧光激活细胞分选 (FACS) 分选的 FLS (CD45-CD31-PDPN+) 从两名滑膜高度发炎的 RA 患者中分离出来，他们具有相似的疾病特征和组织学发现，并使用配对的 scRNA/ATAC-seq 10x Multiome 平台（10X多组学平台）。经过严格的质控，获得了 15,736 个 FLS细胞，这些 FLS细胞基于 scRNA-seq 数据集分为 14 个clusters。在使用和不使用相互最近邻 (MNN) 批量校正的情况下获得了类似的结果。使用已建立的特征标记，确定了lining, sublining and pan-synovial clusters。The latter clusters express genes characteristic of both sublining and lining FLS。与高度滑膜炎症一致，MHC II 类表达广泛，因为在除cluster 13 之外的所有cluster中都发现了表达 HLA-DR 的细胞。对高比例的表达 HLA-DR 的lining FLS 的观察与之前的报道不一致，即HLA-DR+ FLS 代表lining FLS 群体中的一个子集。因此，使用多色免疫荧光 (IF) 独立评估 HLA-DR 表达，并证实 HLA-DR 在 FLS 上的泛滑膜表达。

除了捕获之前在 RA 滑膜中发现的所有 FLS 亚群之外，我们对高度发炎组织中的 FLS 的重点分析能够识别新亚群 sublinin（cluster 0、10、11）和 lining（clsuter 4、6、9）FLS。跨越多个cluster的大量 lining FLS 包括那些共享 FLS 的转录特征特征的 FLS，这些 FLS 来源于患有活动性和缓解 RA4 的患者。这些结果表明，高度发炎的 RA 关节具有极大范围的 FLS 状态，可能代表广泛的疾病谱。

虽然每个cluster都有特定的特征，例如cluster 8中标记血管周围 FLS8 的 NOTCH3 的表达，但每个cluster的基因集富集分析 (GSEA) 突出了cluster之间的共享功能。事实上，通过对cluster相关性的评估，可以定义六个 FLS 状态，每个状态都具有不同的功能。确定的resting lining FLS 状态与来自缓解期的 RA 患者的lining FLS 共享转录谱。表达升高水平的 HLA-DR 的细胞因子激活lining FLS 状态显示出 IFNg 反应基因特征和额外的炎症反应基因特征。泛滑膜 HLA-DRhigh FLS 的特征在于 HLA-DR 的最高表达，并且还显示出 IFNg 反应特征以及溶酶体/内体相关基因（CD63、CTSD、NPC2、LAPTM4A、CTSK、CD68、CTSL、CTSA , HEXA, CTSF, GUSB, LAMP1) 表明它们在发炎的滑膜中作为抗原呈递细胞的潜在作用。这些泛滑膜 HLA-DRhigh FLS 的转录谱与之前报道的活动性 RA4 患者 FLS 的转录谱非常相似。sublining FLS 富含细胞因子信号通路基因，最显著的是 TNFa，还有 IFNg 和 IL-6。值得注意的是，sublining 和细胞因子激活的 sublining FLS 状态都显示了可能由 IL-15 驱动的 STAT5 信号传导的证据。最后，观察到sublining FLS 子集的转录组表现出预期的祖细胞特征，包括最高水平的 CD34 表达，以及与细胞外基质 (ECM) 稳态和上皮间质转化 (EMT) (MFAP5, FBN1、VCAN、TGFBR3、FBLN2、PRRX1、DCN、LAMA2、SFRP4、EDIL3、FBLN1、LGALS1、LOXL1、ADAM12、LOX、CD44、IGFBP4、LRP1）。值得注意的是，对于祖细胞状态表达差异最大的基因是 PI16，它最近被描述为两个通用小鼠（“跨组织”）成纤维细胞群之一的标志物，可以在发育过程中和受到干扰时产生特殊的成纤维细胞群.此外，我们表征的祖 FLS 状态的基因表达特征显示出与 PI16+ cluster的广泛相似性，并富集了在人类扰动状态成纤维细胞图谱中鉴定的“通用成纤维细胞基因特征”。由于组织祖细胞或“干细胞样”细胞经常作为聚集体出现在通常与脉管系统相关的不同专门解剖niche中，使用 IF 探索了这些 CD34highTHY1+PDPN+ FLS 的空间分布。然而，分析发现它们作为孤立细胞广泛分散在整个发炎的滑膜中，与血管内皮没有明显的关联。这一发现表明高度发炎的 RA 滑膜 FLS 的再生能力可能以非分隔方式保存。

Comparison with non-synovial fibroblasts shows shared functionality across tissues

先前基于细胞群的研究表明，人类成纤维细胞在不同解剖位置的转录特征具有明显的多样性及其“拓扑”的可遗传印记。然而，对祖细胞 PI16+ FLS 的保守“通用成纤维细胞”特征的观察表明，受不同病理影响的解剖学上不同的组织成纤维细胞的疾病诱导状态之间可能存在重叠。因此，接下来试图探索确定的其他 FLS 状态是否是组织或疾病特异性的，即滑膜或 RA 相关炎症所特有的，或者与其他疾病和组织中观察到的成纤维细胞群共享。对于这个比较分析，利用了最近几个结肠和真皮成纤维细胞的 scRNA-seq 数据集，其中至少可以描绘出 5 个成纤维细胞clusters。

正如上述“通用成纤维细胞特征”的存在所预期的那样，祖 FLS 状态与来自结肠和皮肤的成纤维细胞具有转录相似性。在结肠中，在与产生肠道干细胞生态位有关的两个成纤维细胞群体中观察到这种转录特征：产生 ECM 的成纤维细胞和肌成纤维细胞。在皮肤中，与健康皮肤相比，在来自未受伤皮肤的负责 ECM 稳态的成纤维细胞和在硬皮病中经历收缩的成纤维细胞群中观察到这种转录特征。

出乎意料的是，观察到结直肠癌中炎症性癌相关成纤维细胞与 HLA-DR+ 细胞因子激活lining FLS 之间存在显著的转录相似性。后一种 FLS 状态也类似于能够成功治愈的糖尿病足溃疡中成纤维细胞的转录状态。

另一方面，患病皮肤或结肠中成纤维细胞的转录特征与我们观察到的静息lining和细胞因子激活的sublining FLS 状态的相似性有限。静息lining FLS 的特点是参与产生滑液和 ECM（XYLT1、FN1、ITGB8、PRG4）和轴突引导（SEMA5A、ANK3、NTN4、SLIT2）的基因高表达，这些特征可能反映了它们在滑膜内的特殊功能。细胞因子激活的 sublining FLS 状态也与 RA 滑膜不同，然而，它可能是由于我们分析的 RA 滑膜样本中的高度炎症而出现的。因此，预计其他组织中相应的成纤维细胞状态仅在类似的高度发炎的条件下被发现，并且可能没有在用于交叉比较的 scRNA-seq 数据集中得到丰富。因此，炎症引起的 FLS 群体整体组成和 FLS 状态谱的扰动与在一系列病理中的其他组织中发现的成纤维细胞共享。

FLS states exhibit distinct transcriptional regulation with evidence of differential cytokine stimulation

为了深入了解促进 RA 中 FLS 异质性的转录因子和上游信号通路，分析了配对的 scATAC-seq 数据集。无监督聚类产生了七个具有 lining 和 sublining FLS 亚型的cluster以及一个独立的祖细胞样 FLS cluster。通过 scRNA-seq 分析识别的不同 FLS 状态占据了 scATAC-seq UMAP 的不同区域，该区域与已识别的 scATAC-seq cluster部分重叠。为了推断已识别的 FLS 状态中的差异转录因子活性，使用 chromVAR 进行了染色质可及性变异分析。对于此分析，使用配对的 scRNA-seq 数据作为过滤器，仅评估其成员由 > 20% 的相应状态的细胞表达的转录因子家族的motif。观察到开放染色质位点内不同转录因子结合基序富集的显著差异，不同状态之间的基序可及性不同。细胞因子激活 lining 和 HLA-DRhigh 泛滑膜 FLS 状态富含 AP-1 转录因子家族成员（JUN、JUNB、JUND、FOS、FOSL2）的活性，其对成纤维细胞生长因子 (FGF) 下游基因调控的贡献增加。和免疫受体信号传导，如 IL-1，已被认为在 RA 中 FLS 的组织破坏特性中发挥作用。有趣的是，细胞因子激活的亚衬 FLS 状态的开放染色质位点富含 STAT 和 IRF 家族基序，这些基序涉及一组不同的炎症通路，例如建立这种状态的 IFN 信号传导。与激活的炎症相关 FLS 的两种主要风味相反，静息lining FLS 状态的特点是同源转录因子家族成员motif的可及性，除了作为发育和组织的主要调节因子外，它还控制成纤维细胞静止（例如 PRRX1 ）。为了支持同源转录因子在调节 FLS 激活中的作用，静息lining FLS 状态表现出同源框家族成员 CUX1 的表达增加，已显示其与 NF-kB 结合并通过下调或上调特定 NF 来改变其活性-kB 调节的细胞因子和趋化因子。最后，PI16+ 祖细胞 FLS 的特点是富含 KLF、SOX 和 TEAD 家族基序的可接近的顺式调节元件，它们在维持干细胞和早期祖细胞的静止未分化状态中发挥作用。在这方面，KLF4 与成纤维细胞中多能状态的诱导有关，这与该 FLS 子集作为祖细胞的可能作用一致。这些结果表明，发炎的 RA 关节中 FLS 的不同状态取决于免疫细胞衍生因子的局部刺激，主要是促炎细胞因子，或避免这些炎症暴露。

Cytokine signaling drives transcriptional heterogeneity

为了测试上述可能性并阐明炎症因子对 FLS 状态转录组的影响，试图通过建立细胞类型特异性细胞因子诱导程序来解卷积其复杂的转录组。为了鉴定免疫细胞衍生的细胞因子转录反应及其对 FLS 状态特异性转录组不同特征的贡献，采用候选促炎细胞因子和其他因子对培养的 FLS 进行体外刺激（实验验证）。对于这些实验，FLS 从四个 RA 滑膜组织样本中分离出来，并在从所有供体汇集 FLS 并一式三份进行刺激之前培养三个通道。 FLS 用与 RA 相关的三种主要细胞因子——TNFα、IFNγ 和 IL-1β，单独或联合刺激——并使用 RNA-seq 评估产生的基因表达变化。此外，为了直接比较每个患者的细胞因子刺激效果，从相同的 RA 滑膜组织样本中分离出 FLS，用 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 或 TNFα 和 IFNγ 刺激它们并进行 scATAC/RNA -seq。分析发现，在体外用 TNFα 和 IFNγ 刺激 FLS 会诱导包括 CCL2 和 IL6 在内的基因表达，这些基因在离体分离的细胞因子激活的亚衬 FLS 中高度表达。On the other hand, genes whose expression was markedly suppressed in response to these cytokines (e.g., VCAN, CCDC80, CD248 in Fig. 4a) were highly upregulated by the CD34highTHY1+PI16+ FLS suggesting that the progenitor FLS state is shielded from exposure to inflammatory mediators and that these cytokines may lead to the loss of this state。同样，在静息 lining FLS 状态下上调的 ANK3 也响应 TNFα 和 IFNγ 的体外刺激而下调，这表明除了sublining中的祖 FLS 外，静息lining FLS 似乎也不受炎性细胞因子的全部作用。最后，在 FLS 中诱导的基因受到 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 组合的体外刺激，包括 MMP3 和 CXCL1，在离体分离的细胞因子激活lining FLS 中差异最大。

由血管内皮表达的配体诱导的 Notch 信号传导被认为是 RA 滑膜中血管周围和下衬 FLS 分化的重要因素。这就提出了一个问题，即 Notch 信号是否可以潜在地调节 FLS 对亚衬内促炎细胞因子的转录反应。为了探索这种可能性，我们研究了在存在或不存在板结合的 Notch 配体 Delta like-4 (DLL4) 的情况下，在用 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 刺激后 FLS 中诱导的基因表达变化。该分析揭示了对所有三种细胞因子的转录反应的总体抑制：对于上调和下调基因，观察到的变化全面减弱。 DLL4 类似地减弱了对细胞因子的双重和三重组合（分别为 TNFα + IFNγ 和 TNFα + IFNγ + IL-1β）的转录反应。考虑到先前的研究表明 Notch 信号传导增强巨噬细胞对 TLR 配体的反应并增加促炎细胞因子的产生，这一发现是出乎意料的。然而，可能有多种特定的调节机制在起作用，因为先前的报道还表明 IFNγ 可以抑制 Notch 信号传导巨噬细胞。这些结果提出了一个有趣的问题，即炎症和发育信号通路的同时参与是否会根据给定的细胞类型导致不同的功能结果。

通过上述体外分析建立的细胞因子反应基因特征映射到我们的 scRNA-seq 数据集揭示了这些基因特征在细胞因子激活lining FLS 状态中最明显的表达。相比之下，细胞因子激活的亚衬 FLS 状态中的主要细胞因子反应特征包括由 TNFα 和 IFNγ 的双重组合或单独的 IFNγ 调节的基因。值得注意的是，祖细胞状态缺乏细胞因子反应基因特征。

先前的 scRNA-seq 分析表明，CD8+ T 细胞是 RA 滑膜中 IFNγ 的主要来源。与之前的报道一致，我们的成像显示 CD8+ T 细胞主要定位在下衬区域的淋巴聚集体中。因此，我们试图通过使用 IF 分析干扰素信号传导的关键下游靶标磷酸化 STAT1 (pSTAT1) 来研究局部 FLS 干扰素反应是否与 CD8+ T 细胞原位定位相关。有趣的是，我们在下衬区域和 T 细胞较差lining区域的淋巴细胞聚集体中观察到 PDPN+ FLS 中的核 pSTAT1。值得注意的是，一些 PDPN+pSTAT1+ FLS 也表达 HLA-DR，这与公认的 IFNγ 在驱动 MHC II 类表达中的作用一致，而在 T 细胞贫乏区域观察到的 pSTAT1 可能反映了局部 I 型 IFN 信号传导。

为了进一步验证细胞因子刺激对基因表达调控的影响，对用细胞因子组合刺激的培养的 FLS 进行了 scATAC-seq，以将在调节的染色质可及性位点观察到的转录因子基序活性与不同 FLS 状态的活性进行交叉引用。离体分离细胞的 scATAC-seq 分析。我们发现，与未刺激的 FLS 相比，用 TNFa 和 IFNg 的组合刺激 FLS 导致 IRF 和 STAT 家族转录因子基序在差异可及的染色质位点富集，与 FLS 离体细胞因子激活的亚细胞状态密切匹配。相比之下，TNFα、IFNγ 和 IL-1β 的三重组合导致在富含 AP-1 转录因子家族基序的位点发生差异染色质重塑。后一种观察结果与先前关于响应 IL-1β 对含有 NF-kB 和 AP-1 结合基序的染色质区域进行重塑的报告一致。令人印象深刻的是，富含 AP-1 家族基序的差异可及位点与在离体分离的细胞因子激活lining FLS 状态中观察到的几乎相同。细胞因子刺激样品与未刺激对照的比较解释了尽管存在强大的 IFNg 反应基因表达特征和 STAT1 磷酸化，但在细胞因子激活的lining FLS 中含有 STAT 基序的顺式调节元件的可及性似乎出乎意料地降低。因此，这很可能是由于 IL-1β、IFNγ 和 TNFα 联合暴露引起的这些元素子集的 STAT 可及性相对降低，而相应的转录水平没有受到显着影响。总之，这些对转录组和表观基因组的分析强烈支持 TNFa 和 IFNg 的组合刺激在促进细胞因子激活的亚衬 FLS 状态的建立中的作用，而细胞因子激活的lining FLS 状态可能是由 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 的三重组合驱动的。

Cytokine signaling is spatially constrained and correlated with cellular localization

上述观察结果表明，炎症滑膜中 FLS 的不同状态是以空间方式建立的，这是由于不同类型的免疫细胞侵入 RA 滑膜而局部产生的炎性细胞因子和其他介质的结果。为了确定 RA 滑膜内已识别 FLS 状态的空间分布，使用 10x Visium 平台结合相邻组织切片的多重 IF 成像对从 RA 患者分离的另外两个发炎的滑膜组织样本进行了空间转录组 (ST) 分析。接受 ST 分析的切片的苏木精和伊红 (H&E) 染色显示明显的淋巴细胞聚集以及丰富的滑膜 lining。与用于 ST 的切片相邻的切片的 IF 成像显示散在的 PDPN+ FLS 和 CD68+ 巨噬细胞以及下衬区域中的淋巴细胞聚集体，以及由 FLS 和巨噬细胞填充的多个lining区域。 ST 数据集与我们的 scRNA-seq 分析集成，以映射 ST 数据集上六个 FLS 状态的转录特征。这表明静息和细胞因子激活的lining FLS 似乎混合在一起而没有形成明确的区域。相比之下，三个已确定的下划线 FLS 子集是差异定位的。接下来将体外 FLS 细胞因子反应基因特征应用于源自 ST 分析的空间基因表达图。发现 IL-1β 反应特征主要映射到滑膜内层，而其他细胞因子反应特征更加分散。由于多个细胞对 Visium 载玻片上的每个 RNA 捕获点都有贡献，通过创建仅包含基于最近对 RA 滑膜的 scRNA-seq 分析，由 FLS 独特表达的基因。相邻切片的综合 ST 和 IF 成像分析表明，具有 IL-1β 反应基因特征的细胞因子激活lining FLS 状态位于 CD68+ 巨噬细胞密集分布的区域附近。将最近对 RA 滑膜的 scRNA-seq 分析的细胞类型特异性转录特征映射到空间基因表达数据集上，证实了单核细胞/巨噬细胞与 IL-1β 反应基因特征的共定位。对独立 RA 样本的类似分析证实了这些结果。这种关联通过 FLS 状态、细胞因子反应基因特征和单个点内的细胞类型特异性基因特征的无偏相关性得到进一步验证，这些特征显示单核细胞/巨噬细胞、lining FLS 和 IL-1β 反应基因特征之间的相关性。这些结果表明，细胞因子信号在发炎的 RA 滑膜内形成多个空间不同的微环境，其中 IL-1β 来自常驻巨噬细胞或定义滑膜lining FLS 的浸润单核细胞。

Discussion

给定组织内实质细胞的表型和功能异质性取决于恒定的细胞内在分化程序和细胞外在线索，这些线索由与组织驻留细胞和浸润细胞的稳定和瞬时相互作用提供。后者大部分由不同类型的免疫细胞代表，当它们被激活时，会产生细胞因子和其他介质，这些介质可以作用于实质细胞，改变它们的生理或稳态范围。在 RA 中，健康的滑膜是一种无屏障的免疫静止组织，它经历了大量先天和适应性免疫细胞的流入。在这种情况下，FLS 经历分化信号，例如在滑膜下层区域形成 FLS 的内皮衍生的 Notch 信号梯度，以及同时暴露于多种细胞因子和其他炎症介质。在体外产生的细胞因子反应特征的辅助下，使用配对的 scRNA/ATAC-seq 和 ST 分析，我们证明白细胞衍生的细胞因子在离散的、空间定义的、但可能具有不同推断功能的动态 FLS 状态的形成中起关键作用。我们还观察到，与报道的巨噬细胞中炎性细胞因子反应的增强相反，FLS 中的 Notch 激活减弱了细胞因子反应。这一发现可以解释在亚衬 FLS 状态中观察到的相对减弱的细胞因子反应基因特征，与细胞因子激活的亚衬 FLS 状态相比，其特征在于最高的 NOTCH3 表达。