9.4培训2

回顾

在上节课中我们知道了，在drop中有大磁珠，小磁珠和细胞。大磁珠上有很多DNA片段，他可以用来吸附小磁珠和细胞中的mRNA。在磁珠上最主要序列片段是barcode和UMI。其中barcode是用于检测测出来的基因是否来源于一个细胞，起到一个定性的作用；而UMI则是对基因的数量进行测行，起到一个定量的作用。（UMI可以用来去除PCR重复）

序列拆分

首先获取测序数据，文件是fastq的格式，而且存在fastq1、fastq2两个文件，他们分别是从3’和5’两个方向测序，可以起到一个提高测序准确度的作用。同时对于一些实验或者学科，我们则需要我们需要特别关注其中的一端的序列。接下来我们要对其中的内容进行拆分，以fastq1-cDNA数据为例，我们需要找出其barcode1、barcode2、UMI以及cDNA序列。然后通过PISA将其转化为fastq＋的文件，同样的对于Oligo的fastq文件也需要将其进行拆分后转变为fastq＋文件。

数据筛选

Barcode筛选：去除非白名单的barcode、如果是单个的测序错误且测序质量较低则校正。用star进行mapping去除一些质量不好的reads，将测序出的不存在于选定基因库上的基因去除。随后对于测序中关于UMI的一些问题进行处理例如去除全是重复序列的UMI、去除bp小于10的UMI、对于不同基因序列但拥有同样的UMI进行校正。生成SAM文件然后用PISA生成BAM文件（在数据处理时用fastq文件但在NCBI中有上传BAM文件，这里需要用bamtofastq包将其转变成fastq文件再做分析）再用GTF对基因进行注释。以及去除barcode捕获量不高的bead。（可能原因：一些细胞在进入液滴前就细胞破裂导致其中基因量下降）

数据汇总

对Oligo的测序序列进行对比，测定大磁珠是否来自于同一drop，将来自于同一drop的基因进行整合，然后质控即去除线粒体DNA最后聚类分析找寻marker。

问题

Fastq1和fastq2两个文件的结果是单纯的完全相反的吗，还是说还有其他别的不同？