培养基百年“串串”，专治各种培养不懂！

hi~大家好！我是三三，又到新一期和大家漫谈科研的时候啦！2020年12月15日，星期二，生科的小伙伴们，你们还好吗？

 

进入2020年的最后一个月，总结\计划\恍惚？也许接踵而来！但是，既然身子已许给了生科这条狗，那么还请君且行且加油，努力充实自己才是王道！

（敲黑板）话不多说，开始我们今天充电10min！

还记吗？曾经的曾经，我们为了记住那些该死的培养基种类，天天嘚嘚着“厌、养、选、基、鉴”？

然鹅，直到现在，培养基的发展可谓是迅猛，各种不同类型的培养基层出不群，再也不是几句顺口溜可以解决的了！那么肿么来才能不为找培养基发愁呢？其实，方法很！简！单！

请“把你的培养基，我的培养基，串一串，串一株幸运草，串成一个培养基发展史！”  

.......  

今天三三就带大家一起来“串一串”培养基的发展史,回顾梳理一下培养基的发展史、细数下当下培养基的种类！

那么，接下来，Ladies and gentlemen，有请欣赏：由巴斯德领衔主演，李斯特、科赫倾心助力的《培养基史话|话第一季：培养基的缘起》。

前情提要：

约瑟夫·李斯特(Joseph Lister，1827～1912)英国维多利亚时代维多利亚女王的私人外科医生，外科消毒法的创始人及推广者，微生物学界的先驱。凭借医学成就获得爵位第一人，人称李斯特男爵。 

巴斯德（Louis Pasteur，1822－1895），微生物学界爸爸级大佬，全身光圈无数，狂犬病疫苗、炭疽病疫苗、巴氏消毒法的缔造者，出生于法国东尔城，毕业于巴黎大学，法国微生物学学家、化学家，微生物学的奠基人之一。人生格言：“科学虽没有国界，但科学家却有自己的祖国。”

科赫[德国]（RobertKoch，1843-1910），现代医学界和微生物学界赫赫惶惶的大咖，病原致病的提出者，固体培养基的发明者等等。

1878年，时任伦敦皇家学院临床外科教授的李斯特，为了研究是什么使牛奶变酸的实验中，第一次成功使用了液体培养基。至此，培养基诞生。

当然，作为最最初代的培养基，虽然是能分离纯化微生物，但是随着巴斯德打开了微生物的大门，液体培养基的局限性也被凸显出来！所以的所以，在没过多久的1881年，巴斯德就发明出了最早的固体培养基——明胶。

但是，作为初代的固体培养基，明胶对温度的敏感可是蛮高的，这使得巴斯德和他的团队不得不再次开始寻找替代品。随后不久，新的替代培养基率先被科赫团队发现发明，  也就是大名鼎鼎的琼脂，琼脂做培养基也被沿用至今。

琼脂	由琼脂糖和琼脂果胶两部分组成的非离子型多糖
化学式	（C12H18O9)n
分子量	3000-6000
熔点	85-95℃
凝点	35-40℃
PH	6~8(非离子型)
水溶性	常温下不溶于水

当然，有小伙伴可能已经发现了，以上这段培养基的发展史基本是围绕着微生物的分离纯化的，那么细胞培养基的发展又是怎么开始的呢？不急！请看《培养基史话|话第二季：细胞培养基的崛起》。

如果说，以巴斯德领衔的培养基的发展史算是培养基初代的话，接下来细胞培养基的诞生可以妥妥滴算是培养基的2.0时代了！

当然，开始之前我们先来认识一下我们培养基2.0时代的领军人物：被后世称之为细胞培养奠基4人组。

关于动物细胞体外维持培养的研究，最早可追溯到20世纪初，但关于细胞培养，这里不得不提起的一人是Harry Eagle博士。他于1955年和1959年在《科学》杂志上最早提出了最低必需培养基，也就是大家熟悉的MEM培养基，至此，细胞培养基的研究序幕也算是正式拉开序幕。

此后的1959年，Dulbecco和Freeman发明了DMEM培养基。Ham分别于1963年和1965年发明了Ham’sF-10和Ham’sF-12，并且在无血清培养上做了初步尝试。

当然，对于基础培养基相比小伙伴们都是比较熟悉的，所以这里将不做赘述。接下来我们开始我们这个接下来的重点“无血清培养基”。

通常在我们试验研究中，为了提供细胞生长所需的激素、生长因子等物质，动物细胞是在含血清的培养基中进行培养的。但血清成分复杂且不完全明确，批次间容易产生较大差异，培养中易发生外源物污染，并且血清本身价格也比较昂贵等；这些均使得血清在生产和研究中的应用存在诸多不利。

此外，伴随着精准医疗等的出现，生物技术从宏观走向微观，以及人们越来越重视的生物安全性、培养效率等，无血清培养基的开发成为摆在眼前的重要课题！

所以，自从1976 年Hayashi 等在提出了无血清培养基的概念，此后，大量生物医药学家开始对无血清培养基进行攻破。截至到80 年代后，无血清培养基的研究与制备广泛发展，到 90 年代已有一些商业化无血清培养基。

目前，已有大量实验数据证实无血清 培养基不仅能避免或改善含血清培养基所带来的上 述缺陷，也能获得良好的培养效果并维持原有生物学功能。

 

欧洲替代方法研究中心科学咨询委员会（Ｔｈｅ ＥＣＶＡＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ， ＥＳＡＣ）和欧洲体外毒理学会（ＥｕｒｏｐｅａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆ ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＩｎｖｉｔｒｏ，ＥＳＴＦＶ）等多个机构组织均发表声明，强烈建议减少细胞体外培养过程中血清等 动物源性物质的添加，尽可能在现有细胞培养领域 使用无血清培养基。所以，无血清被称作“培养基3.0”也不为过了！

 

无血清培养基是在合成培养基的基础上发展起来的，与传统的培养基相比，既能满足细胞在体外长时间培养的要求，又能避免动物血清所带来的不利因素。

 

回顾无血清培养基40多年的发展历程，可以大概分为无血清培养基、无动物源培养基、无蛋白培养基及化学成分限定培养基等四类。

 

类型	描述	应用方向
无血清培养基   （Serum-free medium,SFM）	不添加动物血清，含替代血清材料，如转铁蛋白、胰岛素和动植物的提取物等	可就实际需求进行成分改进，应用广泛
无动物源培养基 animal component free medium ACFM	蛋白水解物、重组蛋白或其他 化学物质来取代动物源蛋白，	生物 药品的研发和生产中
无蛋白培养基 Protein-free medium,PFM）	不含有血清和动物来源 的蛋白，但包含来源于植物蛋白的水解物或合成多肽片段等其他衍生物，	生命科学研 究和基因工 程药物开发 等领域
化学成分限定培养基 Chenically Defined medium,CDM	完全无血清、无蛋白，成分完全明确，可以保证培养基批次间的一致性	研究跟踪细胞培养的代谢情况、分离纯化细胞代谢产物等

 

无血清培养基，作为最新的3.0代培养基，由于对细胞培养的普适性不强，通用性不高，以及成本较高等，所以可能还需要走很长的一段路进行改进与完善。但是，作为当前最可靠、最安全、最高效的培养基，我们还是有很多的实验案例来参考的。所以，三三为各位小伙伴们总结了近年来不同方向培养基典型的论文案例，小可爱们可以进行参考使用无血清培养基，请喜欢的马住了！

 

肿瘤研究方面的应用：

[1]用于研究肿瘤细胞的生长和迁移机理的研究;   参考论文: Kajirom,HirotaR,NakajimaY,etal.TheubiquitinligaseCHIPactsasanupstreamregulatorof -oncogenic pathways[J].Nature CellBiology,2009,11(3): 312-319.     [2]最新研究显示,利用无血清培养基可以从病人原位肿瘤中提取并培养肿瘤干细胞,这类 细胞保留了原有肿瘤的基本特征,并能在免疫缺陷小鼠中诱发肿瘤 的发生｡目前,研究人 员已成功获得了乳腺癌的肿瘤干细胞细胞系,为进一步研究肿瘤发生发展机制提供了有 力的工具和模型｡更为重要的是,无血清培养基去除了血清中的促分化剂,适宜肿瘤干细 胞的富集和培养｡   参考论文:PontiD,CostaA,ZaffaroniN,etal.Isolationandin vitropropagation oftumorigenic breastcancercells with stem/progenitor cell properties [J]. Cancer Research,2005,65(1 3):5506-5511.   [3]具体方向:研究人员已成功获得了结肠癌的肿瘤干细胞细胞系｡ 参考论文:Ricci-VitianiL,Lombardi D G,Pilozzi E,etal. Identification and expansion  ofhuman colon-cancer- initiatingcells[J].Nature,2007,445(7123):111-115.   [4]研究人员已成功获得了神经母细胞瘤的肿瘤干细胞细胞系｡   参考论文:Bate-EyaL T,Ebus M E,KosterJ,etal.Newly- derivedneuroblastomacelllinespr- opagatedinserum- freemediarecapitulatethegenotypeandphenotypeof primaryneurobla stomatumours[J].EuropeanJournal ofCancer,2014,50(3):628-637.     [5]Lei等的研究表明,无血清培养可以增加前列腺癌细胞系DU145中肿瘤干细胞标志物 CD133和CD44阳性的细胞比例 (从0.1% ±0.01%上升至10.3%),并使得原本无CD133 和CD44阳性肿瘤干细胞的PC-3细胞获得了3%的肿瘤干细胞阳性比率;   参考论文:WangL,Huang X,Zheng X,etal.Enrichmentof prostatecancerstem-likecellsfro- m human prostate cancercelllinesbycultureinserum-freemediumand chemoradiotherapy [J]. International Journal of BiologicalSciences,2013,9(5):472-479.   [6]Bouwer等研究显示,他 们利用无血清培养可以彻底解决DC肿瘤疫苗治疗中血清干扰 的问题,并且还保持类似血清培养状态下的生物学功能[28]｡这为进一步安全地应用DC 肿瘤疫苗治疗肿瘤提供了有效方法和理论依据｡   参考论文:BouwerAL,NetterP,KempR A,etal.Adefined serum-free medium useful for  monitoring anti- melanoma responses induced by dendritic cell immunotherapy [J].  Journal of Immunological Methods,2010,352(1/2):178-181.

 

干细胞培养和研究方面的应用：

[1]Swamynathan等通过体外实验验证 MesencultTM间充质干细胞无血清培养基相较有血清培养基,完全 可以为脐带来源的间充质干细胞提供体外大规模培养所需的营养条件;无血清培养基培养的干细胞保留了临床治疗所需要的干细胞特性,并且减少了因血清带来的后续治疗中的潜在危险。

 

参考论文:SwamynathanP,VenugopalP,KannanS,etal.Are serum-freeand xeno-freeculture conditions ideal for large scaleclinicalgrade expansionof Wharton′sjelly derived mesenchymalstem cells?A comparativestudy [J].StemCellResearch& Therapy,2014,5(4):88.

 

[2]研究人员不断开发新型无血清培养基,以提高培养 效率或者适用于不同诱导分化需求｡Zhang等利用含有SCF､TPO､FGF-1､ngiopoietin-like 5 和 IGFBP2等五种因子的无血清培养基可以使人脐血造血干细胞(HSC)在体外生长速度提高20倍,为 临床应用提供培养条件上的支持｡

 

参考论文:ZhangCC,KabaM,IizukaS,etal.Angiopoietin-like 5 and IGFBP2 stimulatee xvivoexpansionof human cord blood hematopoietic stem cells as assayed by NOD /SCIDtransplantation[J].Blood,2008,111(7): 3415-3423.

 

[3]Pick等则开发了一个无血清无滋养培养系统,他们利用该系统 成功从人胚胎干细胞分化获得可产生血小板样细胞的骨髓巨核细胞,这使得人类朝干细胞诱导分化获得治疗用人类血小板又迈进了一大步｡

参考论文:Pick M,AzzolaL,OsborneE,etal.Generation of megakaryocytic progenitors from human embryonic stemcellsinafeeder-andserum-freemedium[J].PloS One, 2013, 8(2):e55530.

 

[4]最近研究报道,为了应对肠道组织天然干细胞来源不足的问题,Mahmoud等开发出一种适宜肠道干细胞体外增殖的无血清培养基,他们添加了乙醇胺､转铁蛋白､抗坏血酸磷酸盐､亚硒酸钠和谷胱甘肽等五种补充因子｡该成果对于基础研究和临床应用均具有积极意义｡

 

参考论文:Mohamed M S,Chen Y,Yao C L.A serum-free medium developedforin vitro expansion of murine intestinalstemcells [J].BiotechnologyJournal,2014, 9(7):962-970.

 

生物制品和生物药物研制与生产方面的应用：

[1]Kutsuzawa等在研究新的3D培养系统时发现,无血清培养基较有血清培养基可提高大约3倍的重组蛋白产量,使该 系统能更好地适用于生物制药生产｡

 

参考论文:KutsuzawaK,TakahashiC,SatoR,etal.Multiarray formationof CHO spheroidscocultured withfeeder cells for highly efficient protein productioninserum- free medium [J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology,2013,13(1):229-235.

 

[2]为避免生物制品的血清污染,Toriniwa等研究得到一种用无血清培养基生产Vero细胞源乙型脑炎疫苗的方法,而且其疫苗可通过添加稳定剂(如山梨醇或甘氨 酸),实现在室温下储存｡

 

参考论文:ToriniwaH,KomiyaT.Long-termstabilityofVero cell-derivedinactivated Japanese encephalitis vaccine prepared usingserum-freemedium[J].Vaccine,2008, 26(29/30):3680-3689｡

 

[3]:Rodrigues等利用CHO细胞生产单克隆抗体时发现,在无血清条件下培养,就无血清培养基的基础培养基适应性进行了对比评价,指出相比于DEME培养基,EX-CELL培 养基更有利于单克隆抗体的生产,这为后续单抗的研发生产奠定了良好的基础｡

 

参考论文:Rodrigues M E,Costa A R,Henriques M,etal. Advance sand draw back soft headaptationtoserum- freecultureofCHO-K1cells formonoclonalantibody production [J].AppliedBiochemistry and Biotechnology , 2013,169(4):1279-1291.

 

[4]:Kuroda等在研发慢病毒载体生产方法时,开发了培养人胚肾HEK 293细胞的无蛋白培养基,从而获得了低成本､无批次差异且高滴度的慢病毒载体｡

 

参考论文:KurodaH,KutnerR H,BazanNG,etal.Simplified lentivirus vector production in protein-freemediausing polyethylenimine-mediatedtransfection[J].Journalof Virological  Methods, 2009, 157(2) : 113-121.

 

话说，不以种草为目的的安利都是耍流氓！三三今天为大家推荐下自家的无血清培养基系列：

 

(一)X-VIVO无血清造血细胞培养基

 

化学成分限定，为包括淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、外周血淋巴细胞(PBL)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在内的多种细胞提供营养完整和平衡的环境。这些培养基不包含任何外源性生长因子、人工促进细胞增殖的物质或未定义的补充物。它们不含任何蛋白激酶C刺激因子，适用于研究人类和小鼠淋巴细胞激活中的第二信使系统。

 

✍X-VIVO产品都已经在FDA备案。

 

 

(二）UltraCulture培养基

✍UltraCULTURE™培养基（12-725F）是一种通用型无血清培养基，用于培养多种哺乳动物细胞类型。

 

✍UltraCULTURE™培养基主要DMEM：F-12、重组人胰岛素、牛转铁蛋白和牛血清蛋白混合物（包括白蛋白）组成。

 

✍UltraCULTURE™培养基的总蛋白质浓度约为3mg / ml，不含L-谷氨酰胺，因此使用时每500mL培养基需要添加200mM的L-G（17-605）5mL。

 

✍UltraCULTURE ™培养基已经在FDA备案。

 

✍培养多种哺乳动物的原代细胞和确立细胞株（包括单核细胞、巨噬细胞细胞系、上皮细胞和成纤维细胞；UltraCULTURE培养基添加

5%的胎牛血清也能够用于内皮细胞的培养）

 

✍在杂交瘤形成期间促进细胞融合；

✍疫苗生产中促进病毒颗粒的产生；

✍可以添加防冻剂（12-132A）后在无血清环境冻存细胞。

 

注意：UltraCULTURE™培养基可能会出现浑浊，但不影响使用（使用过程中导致的污染不涵盖在内）。

 

黄金组合：

500mL UltraCULTURE ™（Lonza，12-725F）+10mLUltroser ™ G （Pall，15950-017）+5mL L-G（17-605E）

 

用于多种干细胞（间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞）的培养研究。

 

 

参考文献：

[1] Miriam Y. Kim,et al(Cell,2018).Genetic Inactivation of CD33 in Hematopoietic Stem Cells to Enable CART Cell Immunotherapy for Acute Myeloid Leukemia.—X-VIVO 15添加5%人血清、青链霉素和谷氨酰胺培养筛选出的CD34+ T细胞，用含有CAR33构建体的慢病毒转染T细胞，敲除CD33基因，靶向AML细胞表面抗原，保留正常骨髓祖细胞的造血功能，从而治疗急性髓系白血病。

 

[2] Justin Eyquem,et al(Nature,2017).Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumourrejection.—X-VIVO 15添加5%人血清、200U/mL IL-2培养CD3/CD28激活的T细胞，用CRISPR/Cas9将CD19特异性CAR基因靶向导入TARC位点，可增强抗肿瘤效果。

 

[3]Jang Hwan Cho(2018).Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses.—UltraCulture添加2mM L-G、200U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、5mM丁酸钠培养转染后的HEK293制备慢病毒，收集病毒后，接种到用X VIVO 15培养的T细胞进行后续实验。

 

[4] Nathalie Meuleman (2006).Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free medium allows better expansion than classical a-MEM medium.—UltraCulture添加2% Ultroser G（PALL）、2mML-G、1%抗生素-抗真菌药培养MSC，培养的细胞数量和细胞的多功能性均比添加15%FBS的α-MEM好。

 

[5] Oksana Lockridge(2018).Comparison of Hupresin® to procainamide-Sepharose for purification of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase

培养CHO，用于表达部分糖基化人丁酰胆碱酯酶;

 

[6]Hua-Jiang Dong(2017).The Distribution of Transplanted Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Large Blood Vessel of Rats With

Traumatic Brain Injury.用于培养人脐带间充质干细胞;

 

[7]Ming Zhu, (2017).Curcumin protects mesenchymal stem cells against oxidative stress-induced apoptosis via Akt/mTOR/p70S6K pathway.用于大鼠来源MSC的培养.