［摘 要］运用 ＰｉｇｇｙＢａｃ转座子系 统，通过嘌呤霉素筛选构建稳定表达荧光素酶的 Ｕ８７ＭＧ 细胞株（Ｕ８７ＭＧ － ＦＬＵＣ）。通过流式细胞术检测 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ细胞株纯度达到１００％。该细胞系传代后能稳定表达荧光素酶，且 生物发光的强度与细胞个数成正比。将该稳定表达荧光素酶的细胞接种于免疫缺陷型小鼠的颅内，肿瘤接种后的 ７ｄ，利用活体成像仪对植瘤小鼠进行检测，确定肿瘤的大小以及位置。结果表明：接种了 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ细胞的裸 鼠，均长出肿瘤；成功构建了表达荧光素酶的 Ｕ８７ＭＧ细胞株，且人脑胶质瘤细胞系的裸鼠肿瘤模型构建成功。 ［关键词］Ｕ８７ＭＧ；荧光素酶；生物发光；细胞株 ［中图分类号］Ｒ７３ ［文献标识码］Ａ
脑胶质瘤是对神经功能影响最大、最直接的神 经外科疾病。脑胶质瘤具有较高的侵袭性，即便采 取手术及放化疗等治疗措施，预后依然较差，大部分 脑胶质瘤患者在接受综合治疗后仍容易复发［ １］。建立一个稳定的胶质瘤动物模型可以更好地帮助研究 针对脑胶质瘤的治疗方法。常见的脑胶质瘤模型通 常需要处死荷瘤小鼠，这样一来就不能实时且准确 地反映肿瘤在裸鼠体内 的生长状况［ ２ －３］。活体动物体内光学成像技 术主要包含生物发光或激发荧光两 种技 术，前 者 如 荧 光 素 酶，后 者 如 绿 色 荧 光 蛋 白 等［ ４］。荧光成像既可以标记动物、细胞和微生物，也 可以是抗体或纳米材料等较广泛的对象。生物发光 不需要激发光源背景，且具有较高的特异性和灵敏 性，是研 究肿瘤生长及发展稳定且有效的 技 术手 段［ ５ －７］。人脑胶质瘤的研究中，Ｕ８７ＭＧ 是最常 用 的 细胞系之一［ ８］，将带有荧光素酶（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）的质粒ＰＢＤＰ －Ｆｉｒｅｌ ｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ 利 用 Ｌｉ ｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ ３０００ 转染进入 Ｕ８７ＭＧ 细胞，得到稳定表达荧光素酶的 细胞系。将表达荧光素酶的 Ｕ８７ＭＧ细胞原 位注射 进入裸鼠的颅内，建立表达荧光素酶的裸鼠模型，并通过动物活体成像技 术观察脑胶质瘤在裸鼠体内的 生长和发展［ ９］，并对该细胞株的成瘤性进行评估。
１ 实验材料
ＰＢＤＰ －Ｆｉｒｅｌ ｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ质粒由本实验 室前期 的实验 研 究中构建完成； ｐＳＰＢＴ 辅 助质粒由 Ｓｙｓ － ｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司获得；Ｕ８７ＭＧ 细胞从中国科学院 细 胞 库 购 得；Ｕ８７ＭＧ 及 改 造 后 的 细 胞 株 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ均用 ＤＭＥ／Ｆ － １２（ＨｙＣｌｏｎｅ，ＵＳＡ） 培养；胎牛血清购自四季青品牌（浙江天杭生物科技 股份有限公司）；转染试剂盒 Ｌｉ ｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ ３０００购 自 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司；转染介质培养基 用 ＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ，ＵＳＡ），荧光素酶底物购自碧云 天生物技 术公司；无 内毒素大提试剂盒购自天根生 物科技有限公司；嘌呤霉素购自Ｐｒｏｍｅｇａ。 ２
实验方法
２． １ 筛选 Ｕ８７ＭＧ的最佳嘌呤霉素浓度 将培养于１０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养基中的 Ｕ８７ＭＧ细胞消化得细胞悬液，按照５×１０ ４个／孔的 细胞量接种于２４孔板中，放置于５％ ＣＯ２、３７℃培 养箱中培养２４ｈ。嘌呤霉素按照０、 ５、１０、１５、２０、 ２５、３０μｇ／ｍＬ设置浓度梯度，连续观察 Ｕ８７ＭＧ 细 胞的生长及存活状 态。细胞在５～７ｄ内 全部死亡 的孔所对应的嘌呤霉素浓度，将最低致死浓度选为 筛选单克隆 Ｕ８７ＭＧ细胞的最佳浓度。
２． ２ 转染 Ｕ８７ＭＧ细胞 将处于对数生长期的 Ｕ８７ＭＧ 细胞，以５×１０ ４ 个／孔的细胞量接种于２４孔板中培养２４ｈ，当细胞 汇合度达到９０％左右时转染质粒。按照 Ｌｉ ｐｏｆａｃ － ｔａｍｉｎｅ ３０００说明书 进行转染实验，将 ＰＢＤＰ －Ｆｉｒｅｌ ｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ质粒和ｐＳＰＢＴ质粒按照５∶１的质量比 加入到无血清的 ＭＥＭ 培养基中记为 Ａ 管，向 Ａ 管 中加 入 Ｐ３０００ 试 剂。 将 Ｌｉ ｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ ３０００ 与 ＭＥＭ 混合记为 Ｂ管， Ａ 管与 Ｂ管轻微混匀室温静置１０ｍｉｎ后，加入到培养的 Ｕ８７ＭＧ 细胞中，并继 续培养４８～７２ｈ，观察 ＧＦＰ荧光蛋白表达的情况， 并用嘌呤霉素进行筛选。
２． ３ 筛选单克隆细胞 用嘌呤霉素筛选后的细胞，ＧＦＰ表达达到７０％ 以上时消化细胞获得细胞悬液，再将细胞悬液梯度 稀释至５００个／ｍＬ接种于９６孔板中，使每孔１～２ 个细胞。培养２４ｈ以上观察细胞，记录仅有单个细 胞的孔。
２． ４ 流式细胞术检测单克隆细胞株的纯度 荧光显微镜下选取表达 ＧＦＰ荧光蛋白的单克 隆细胞，扩培至６孔板中，待细胞汇合 度达到９０％ 时，消化细胞并用 ＰＢＳ清洗重悬细胞，用 ＢＤ Ｃ６ 流 式细胞仪检测 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ中 ＧＦＰ的表达率，并 用ＦｌｏｗＪｏ ＶＸ分析流式结果。
２． ５ 各单克隆细胞株荧光值检测 消化筛选出来的单克隆阳性细胞株，用 ＰＢＳ重 悬细胞并按照梯度稀释为４×１０ ５、２×１０ ５、１×１０ ５、 ５
×１０ ４、２．５×１０ ４、１．２５×１０ ４、６２５０、３１２５个细胞接种 到９６孔板中，设置仅有ＰＢＳ的孔作为空白对照，加 入等体积工作浓度 的 Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，使用多功能酶标 仪分析生物发光强度。
２． ６ 细胞生长曲线绘制 取筛 选 的 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ 细 胞 和 为 改 造 的 Ｕ８７ＭＧ细胞，按照１×１０ ４／孔接种至９６孔板中，接 种后的２４，４８，７２及９６ｈ消化细胞并计数。
２． ７ ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠颅内植瘤模型的建立 ＢＡＬＢ／ｃ 裸 鼠，６ 周 龄 雌 性 ２ 只。 收 集 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ单克隆细胞，用 ＰＢＳ清洗重悬为２ ×１０ ７／ｍＬ。２只裸鼠颅内接种５０μＬ 的 Ｕ８７ＭＧ － ＦＬＵＣ细胞悬液。注射细胞悬液后的７ｄ，用动物活 体成像系 统（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）拍摄生物 发光。
３ 实验结果
３． １ 质粒转染 Ｕ８７ＭＧ细胞并用嘌呤霉素筛选 选用 ＰＢ 转座子载体质粒 ＰＢＤＰ－Ｆｉｒｅｌ ｙ Ｌｕｃｉｆ － ｅｒａｓｅ和辅 助质粒 ｐＳＰＢＴ。其中 ＰＢＤＰ －Ｆｉｒｅｌ ｙ Ｌｕ － ｃｉｆｅｒａｓｅ质粒上带有绿色荧光蛋白 ＧＦＰ标签，作为 质粒转染细胞的检测标记物。 经过嘌呤霉素筛选之后，确定了添加嘌呤霉素 的最佳添加浓度为１５μｇ／ｍＬ。将ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）转 座子载体质粒系 统 ＰＢＤＰ －Ｆｉｒｅｌ ｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ质粒和 辅助质粒ｐＳＰＢＴ转染进入 Ｕ８７ＭＧ细胞中，２４ｈ后 可见明显的绿色荧光，表明转染成功。向转染后的 细胞中加入１５μｇ／ｍＬ 的嘌呤霉素，每 ２４ｈ观察
Ｕ８７ＭＧ细胞，５ｄ后质粒未转染成功的细胞死亡， 存活的均为 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ细胞。
３． ２ 挑取 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ单克隆细胞株 将转染成功的 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ细胞，稀释加入 ９６孔板中培养。２４ｈ后挑出仅有单个细胞的孔继 续培养扩增，当细胞汇合 度达到８０％以上后选取细 胞形态未发生变化的 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ单克隆细胞株 两株，观察其表达绿色荧光蛋白的情况（图１）。
３． ３ 流式细胞仪检测 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ单克隆细胞 通过流式细胞仪检测 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ细胞株的 绿色荧光蛋白 ＧＦＰ的表达，对照组为未转染质粒的 Ｕ８７ＭＧ培养细胞（图２），Ｅ７细胞株的 ＧＦＰ表达率 达到９８．７％，Ｄ３细胞株的 ＧＦＰ表达率达到１００％， 选取 Ｄ３株做进一步的研究。
３． ４ Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ 细胞系的生长特性及荧光素 酶的表达 对不同培养时间的 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ单克隆细胞 进行细胞计数。观察到 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ单克隆细胞 与未改造的 Ｕ８７ＭＧ 细胞有相似生长曲线（图３）。 选取第６， ９，１２代次的 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ细胞加入荧 光素酶底物检测，随着细胞培养代次的增加，荧光素 酶活性保持稳定（图４）。进一步，取第１２代进行梯 度稀释，荧光素酶活性 与细胞个数成线 性相关（ Ｒ ２ ＝０．９７０６）（图５）。
３． ５ 裸鼠颅内植瘤模型的建立 收集 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ 细胞，对裸鼠颅内接种。 ７ｄ后使用小鼠活体成像系 统检测到裸鼠颅内有明 显的荧光信号。
４ 结束语
通过转染质粒，构建了稳定表达荧光素酶的 人 脑胶质瘤细胞系。细胞内表达荧光素酶可以催化体 外导入的荧光素酶底物 Ｄ －荧光素，所产生的５５０～ ５８０ｎｍ 的荧光，具有较强的组织穿透能力，可有效 穿透深层组织［ ５］。对于无法使用游标卡尺直接对病 灶进行测量的脑胶质瘤的模型而言，产生荧光素酶 的肿瘤细胞系更能清晰反映肿瘤的发生和发展过 程，为观察肿瘤病灶的形成提供直观且可以量化 的 数据［ ７，１０］。 本实验将ＰＢＤＰ －Ｆｉｒｅｌ ｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ和ｐＳＰＢＴ转 入到 Ｕ８７ＭＧ中，通过嘌呤霉素筛选出稳定表达荧 光素酶的细胞株，并通过流式细胞仪选取高纯度 的 Ｕ８７ＭＧ－ＦＬＵＣ细胞。得到的细胞株能稳定表达荧
光素酶，且其表达量及强度不会随着细胞传代而衰 减。进一步建立的裸鼠颅内植瘤模型，则通过对实
验裸鼠正位和侧位的拍摄确定了瘤体在颅内 目标位 置形成，有较强的生物荧光信号。本实验可以延长 裸鼠颅内成瘤的观察时间及裸鼠荷瘤的生存期。
目前研究中活体动物体内光学成像技 术多应用 近红外ｉＲＦＰ和 ＧＦＰ蛋白来成像，但是对于脑胶质 瘤这种成瘤位置较深、能植入细胞悬液体积较少的 瘤体模型来说，荧光素酶成像更加灵敏，是更为合适 的选择。
参考实验材料：
小鼠活体成像是科学研究和药物研发的常用方法。进行此实验的前提是必须要有能稳定表达发光基因的细胞。常用的发光基因包括萤火虫萤光素酶（firefly luciferase，Fluc）、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（tdTomato）。本部分汇集了几种常用的稳定转染了Fluc的癌细胞系，并从Fluc、GFP、tdTomato转基因动物体内分离得到了发光的免疫细胞。这些细胞是进行基础研究和药物研发的常用工具。
［ 参 考 文 献 ］
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［ ８］ 王艳华，楚建杰，杨志福，等．人 Ｕ８７－ＭＧ脑胶质瘤细 胞裸鼠原 位移植模型的建立［ Ｊ］．中国药理学与毒理学 杂志，２０１６（１０）：１０６５ －１０６５． ［ ９］ 张绘宇，郑国兵，张金栋，等．利用荧光素酶标记的肿 瘤细胞建立活体成像动物模型［ Ｊ］．中国体视学与图像 分析，２０１３（ １）：６７ －７２． ［ １０］Ｎｏｔｔｉｎｇ Ｉ Ｃ，Ｂｕｉ ｊ ｓ Ｊ Ｔ，Ｑｕｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｗｈｏｌｅ －ｂｏｄｙ ｂｉｏｌｕ － ｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｖｅａｌ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｔｕｍｏｒ ｇ ｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ［ Ｊ］． Ｉｎｖｅｓｔｉ ｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５， ４６（ ５）：１５８１ －１５８７．
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