【Reference reading】用19F标记的BPA-果糖复合物在C6老鼠胶质瘤模型的19F MRI和19F MRS来优化硼中子捕获治疗(BNCT)

论文：In vivo 19F MRI and 19F MRS of 19F-labelled boronophenylalanine–fructose complex on a C6 rat glioma model to optimize boron neutron capture therapy (BNCT)（2008）

Abstract

硼中子俘获疗法(BNCT)是一种很有前途的治疗恶性脑胶质瘤的二元模式。为了优化BNCT的有效性，需要一种无创的方法来监测BNCT载体的空间分布，以估计中子辐照的最佳时机。在本研究中，使用19F磁共振成像(19F MRI)和19F磁共振波谱(19F MRS)对19F标记的硼苯丙氨酸(BPA)进行体内空间分布定位和药代动力学评价。C6胶质瘤中19F-BPA的特征提取在复合物注射后2.5小时达到最大值，这一点在注射后不同时间采集的血样的19F图像和19F光谱中都得到了证实。本研究显示19F MRI能够选择性地绘制C6大鼠胶质瘤模型中19F-BPA的生物分布，为BNCT载体的药代动力学研究提供了一种有用的方法。

1. Introduction
硼中子捕获疗法(BNCT) (sauerwe1993, Sweet 1997, Coderre and Morris 1999, Coderre et al 2003, Barth et al 2005, Pisarev et al 2007)是一种主要用于治疗恶性胶质瘤(间变性星形细胞瘤(AA)和多形性胶质母细胞瘤(GBM))的二元放射治疗方式(Soloway et al . 1967, Hatanaka and Nakagawa 1994，Nakagawa and Hatanaka 1997, Van Rij et al 2005, Yamamoto et al 2008)。这些高级别肿瘤确实是人类脑癌中最具侵略性的，并且对目前所有的治疗方式(切除手术、常规放疗和化疗)都具有极强的耐药性。它们的快速生长和浸润性质很快导致肿瘤复发(80-90%的GBM在局部复发)(Yamamoto等，2008)。因此，恶性胶质瘤预后非常差，中位生存时间(MST)为6 ~ 12个月。

在治疗这些原发性脑肿瘤的治疗策略中，BNCT具有潜在的疗效前景：它需要在肿瘤中选择性地积累10B标记化合物，然后用低能量(E≤0.4 eV)热(nth)或超热(0.4 eV < E < 10 keV)中子束。具体来说，BNCT基于核反应10B(n，α)7Li (10B + nth→[11B∗]→α+ 7Li + 2.79 MeV) (Sauerwein 1993）当稳定同位素10B(特征是一个大的热中子俘获截面)捕获一个热中子时，产生不稳定形式的11B，它立即分解成高能的粒子和反冲的7Li离子。由于它们的高线性能量传递(LET)，这些重带电粒子沿着它们的组合路径长(<14um) (IAEA 2001)(与哺乳动物细胞尺寸比较)释放大部分的电离能量，因此限制了辐射对含有10B的细胞的伤害。有效BNCT需要大量的10B原子(每个细胞大约10e9个10B的原子或20-35ug 10B/g)(Barth和Soloway 1997)必须选择性地积聚在肿瘤细胞内，同时必须达到肿瘤对大脑(T:Br)的高10B浓度比至少3:1，以确保对肿瘤的治疗剂量与最低的background辐射剂量。

BNCT治疗已经在世界各地的几个中心进行了优化和安全性和有效性评估(Coderre et al 1998, Chanana et al 1999, Capala et al 2003, Joensuu et al 2003, Miyatake et al 2007)。然而，第一阶段(毒性)(Chanana et al 1999, Palmer et al 2002, Busse et al 2003, Diaz 2003, Burian et al 2004)和第二阶段的结果(疗效)(Busse et al 2003, Diaz 2003, Enriksson et al 2008)临床试验尚未显示出优势来证明随机III期BNCT研究的有效性。这些unexciting结果主要是由于肿瘤细胞中对10B标记化合物的吸收不足，以及缺乏一种有效的成像方法来监测10b载体的生物分布，以便估计中子辐照的最佳时机(Kageji等，2001年)。此外，由于BNCT是一种生物学靶向形态，而非几何靶向形态的特性，10b标记化合物可以达到可能的亚临床病变，而这些亚临床病变不能被定义成像，并取得了理想的治疗效果。中子辐照的理想时间为肿瘤-脑(T:Br) 10B浓度比达到最大时。

目前在BNCT临床试验中使用最广泛的硼载体是必需氨基酸苯丙氨酸的硼化衍生物，p-硼苯丙氨酸(BPA)。由于其在生理pH值下的低溶解度，它被作为与果糖的复合物(BPA-fr 复合物)使用(Yoshino等，1989)。人们普遍认为，BPA通过血脑屏障被积极运输到正常的胶质细胞中，而它在肿瘤中的吸收是由于氨基酸通过肿瘤细胞膜的运输速度加快(Wittig et al 2000)。此外，在细胞周期(S期)期间，肿瘤细胞内的BPA积累会增加(Nichols et al . 2002)因此，它用于治疗脑胶质瘤可能是一种优势。正电子发射断层扫描(PET)对18F标记的BPA进行了药代动力学研究，证明了肿瘤中大量的BPA摄入，而不是像Imahori等人(1998年)和Kabalka等人(1997年)所报道的那样在邻近的正常组织中。

为了BNCT治疗的有效性，研究10B载体的药代动力学行为和硼的空间生物分布对评价载体的效率和最佳辐照时间至关重要。

到目前为止，已有几种技术(Wittig等，2008年)被用于确定10B药物的空间分布和药代动力学(Coderre等，1998年，Elowitz等，1998年，Imahori et al 1998, Ryynanen et al 2000, 2002, Laakso et al 2001, Kabalka et al 2003，Wang等，2004)。其中，磁共振成像(MRI)和光谱学(MRS)是在BNCT治疗过程中对10B化合物进行体内非侵入性和非破坏性实时监测的强大而有用的方法。然而,10B NMR方法的由于低灵敏度和强烈的质子背景信号(Bendel et al 2001 a, 2001 b, Bendel 2005),使1H MRS(左等1999)和核磁共振光谱成像(MRSI)Bendel et al 2005)技术在体内存在问题，通过NMR检测BPA的新策略正在研究中。在之前的一篇论文(Porcari et al 2006)中，我们提出了一种检测BPA的新方法。使用的策略是使用19F NMR以类似PET研究的方式绘制19F标记的BPA -fr复合物(19F -BPA -fr复合物)(Imahori et al 1998,
Kabalka et al 2003, Wang et al 2004)。该方法的可行性已在体外得到证实(Porcari et al 2006)。现在，由于19F核素的性质，19F核磁共振探针在体内分子成像中具有很大的应用前景(Bulte 2005, Higuchi et al 2005, Mizukami et al 2008)。事实上，19F具有100%的天然同位素丰度，高回旋磁比(γF = 40.05 MHz/T)。此外，由于19F和1H接近于γ值(γ F = 40.05 MHz/T, γ H = 42.58 MHz/T)通过适当调节射频线圈，一般可使用1H NMR仪器进行19F NMR。这可能是一个非常有用的优势，为未来的临床应用。此外，含有19F的化合物，如19F-BPA-fr复合物，具有在特定位点聚集的能力，被外源管理到生物体。因此，它们可以在没有背景磁共振信号的情况下在体内进行监测。事实上，只有少数的19F原子集中在活体动物体内(大部分在骨骼和牙齿中)，因此内在的19F MRI信号很难被检测到。近年来，出现了一类含有19F(也称三氟甲基)和10B原子的新型化合物(Hattory et al 2007))被设计和合成在单个分子中(Hattory et al 2006)用于开发BNCT和MRI的实用工具。

本研究的目的是：(1)采用19F MRI评估C6荷瘤大鼠与正常脑19F - bpa - fr复合物的选择性生物分布；(2)利用19F MRI和MRS评估19F标记的BPA的药代动力学，以估算中子照射的最佳时机。C6大鼠胶质瘤模型虽然与人类胶质母细胞瘤存在显著差异，但其特征较好，常用于类似研究，因此我们选用该模型。在本文中，我们报道了使用19F-BPA-fr复合物对C6荷瘤大鼠的体内实验结果。其中，19F-BPA-fr复合物给药后获得大鼠脑的19F MRI图像，以评估化合物的空间分布图谱，以及血液标本(在注射后不同时间从股静脉采集)的19F高分辨率NMR谱。

2. Materials and methods
2.1. Chemicals
Racemic 10B富集19F-BPA购自Katchem Ltd(捷克共和国布拉格)。 由于19F-BPA的水溶性较差，我们将其与果糖络合制备了给动物用的生理溶液(pH = 7.4) (19F-BPA - fr络合物)。与果糖的络合过程已在别处详细叙述(Porcariet al 2006)。
2.2. Animal model
2.2.1. Cell line. C6细胞(Istituto Zooprofilattico Sperimentale “B. Ubertini”, Brescia, Italy)在含15%马血清、2.5%胎牛血清和在37°C，和空气中的抗生素(青霉素/链霉素)在湿度5%二氧化碳/95%的Ham 's F10培养基中培养。培养基所用材料均由生物技术服务中心和Animal Welfare, Istituto Superiore di Sanita (Rome, Italy)提供。

2.2.2. Tumour implantation. 体重300-350 g的8周龄雄性Wistar大鼠成功诱发脑胶质瘤(Service for Biotechnology and Animal Welfare, Istituto Superiore di Sanita, Rome, Italy)。所有与动物护理相关的程序都是按照代表意大利执行欧洲指令86/609/EEC的法令116/92执行。

手术前，每只大鼠腹腔麻醉氯胺酮(90 m/kg b.w;Ketavet 100,Intervet)与盐酸美托咪定(0.4 mg/kg b.w;Domitor, Pfizer)，然后放入立体定向框架(Stoelting Co.， Wood Dale, IL, USA)。在头皮中部做一个切口，在右半球钻一个小洞(右冠状缝前2mm，矢状缝外侧3mm)。特别注意保持硬脑膜完整，以防止出血和脑脊液漏。随后，使用Hamilton注射器(26号针)，在离硬膜层4毫米的深度，通过小孔缓慢注入C6细胞悬液(106个细胞，每10个微孔)(10分钟)。注射结束两分钟后，注射器慢慢取出。然后用蜡烛蜡覆盖毛刺孔，用生理盐水冲洗手术野，缝合头皮。手术过程中无并发症发生。

2.3. Magnetic resonance measurements
2.3.1. 19F–BPA–fr complex infusion and MR imaging.体内质子和氟成像使用7T水平内径磁共振扫描仪(Bruker Biospec 70/15)进行，该扫描仪配有适合小动物的双调谐1H-19F表面线圈(直径40 mm，最大梯度强度50 mT m−1，上升时间800 ms)。成像前麻醉(如上)，将大鼠平卧放置于自制大鼠床上。表面线圈被直接放置在大鼠颅骨下，以bregma为中心。然后，大鼠被插入磁体，其头部位于磁体的等中心点。在MRI检查中，体温通过加热毯保持在36-37摄氏度。

1H MRI监测肿瘤植入及进展情况。C6胶质瘤细胞植入5天后，第一次扫描大鼠，随后每4天扫描一次。采用以下参数对大鼠脑进行t2加权(T2-w)自旋回波(SE)轴向1H成像:cho time (TE) = 40 ms, repetition time (TR) = 2500 ms, field of view (FOV) = 40 × 40 mm2, matrix dimensions (MTX) = 128 × 128 (in plane resolution = 312 µm × 312 µm), number of average (NA) = 2 (total imaging time = 10 min), number of slices (NS) = 4, slice thickness (ST) = 1.5 mm。当肿瘤大小达到最小直径约2毫米时，大鼠被分配到19F-BPA-fr复合管理。（给大鼠注射药物）。在输注前，每只大鼠再次麻醉(如上所述)，由神经外科医生进行手术准备。右颈内动脉插管(25-gauge Teflon catheter;
Ethicon)，19F-BPA-fr(300 mg/kg b.w.)复合溶液使用输液泵(Harvard Apparatus Co., Cambridge, MA)以恒定的低流速给予(100 µl/min)。拔除导管，结扎颈内动脉，缝合切口。在手术和输液过程中，两只大鼠死于呼吸并发症。体内19-BPA空间分布图采用19F MRI进行绘制。19F-BPA-fr复合物输注结束后，各大鼠采用相同的采集方案进行成像。首先，采集1H T2-w轴向扫描，采集参数与上述报道相同，用于解剖参考。然后将线圈调到19F频率(282.35 MHz)，得到相应的19F MR脑轴图像。由于19F-BPA在血液中的19F横向弛豫时间(T2)等于5.4 ms (Porcari et al 2006)，因此采用512us hermite 90°选择性脉冲和200us 180°硬脉冲的SE序列来最小化TE（不懂）。采集参数如下:TE = 4.3 ms, TR = 1800 ms, FOV = 120 × 120 mm2, MTX = 64 × 64 (in plane resolution = 1.85 mm × 1.85 mm), NA = 40 (total imaging time = 77 min), NS = 1 and ST = 40 mm。19F-BPA注射结束后2h开始采集19F MR，并在4小时内收集连续扫描(特别是在注射后2.5、4和5小时)，以监测19F-BPA-fr复合物的生物分布。后来，再次采集T2-w轴向扫描(采集参数相同)以评估大鼠位置。将19F MR图像(色阶:低=蓝，高=红)叠加到对应的1H图像(灰度)上，得到19F-BPA-fr复杂空间分布映射。使用Matlab软件对1H和19F图像进行处理(version 7.4, R2007a)。由于19F图像没有切片选择性，所以1H图像是通过叠加相关的质子切片得到的。相反，19F图像在相同的1H图像分辨率(312um×312um)上重新采样，采用双三次插值，阈值固定在信号最大值的70%。

2.3.2. 19F MR spectroscopy.为了评估药代动力学研究和支持成像数据，在19F-BPA- fr复合物注射后不同时间(1,2.5和4h)从右股静脉采集血液样本。每只大鼠均行手术预备，右股静脉插管。在肝素涂层的试管中采集血样(每500个单位)。在这种情况下，一只老鼠在手术中死于出血并发症。

使用9.4 T垂直口径高分辨率光谱仪对每个血液样本采集19F核磁共振高分辨率光谱(Bruker Avance-400)。所有的光谱采集采用TR = 5 s，扫描4000次取平均值，用等于1 Hz指数滤波器的线展宽(LB)进行处理。通过峰值积分实现光谱定量。对于每个光谱，测量所有峰的全宽半最大值(FWHM)，得到横向弛豫时间T2∗(定义为FWHM = 1/(Π T2∗))。

3. Results and discussion
3.1. Imaging results
为了评估C6动物模型中19F-BPA在体内的硼分布，我们对注入19F-BPA的大鼠进行1H和19F MRI联合检查。如图所示, C6细胞植入后14天1H MRI监测每只大鼠出现直径约2-3毫米的脑瘤。19F-BPA输注2 h后，收集1H T2-w扫描，供解剖参考。在图1中，显示了三个连续的1H轴向大鼠脑覆盖肿瘤扩展的切片(图1(a) - (c)中的箭头)。磁共振采集1H后立即获得大鼠脑19F轴向图像(图2)。由于脑组织中缺乏19F背景MR信号，所以19F MR图像中的高强度区域(图2)仅来源于19F-BPA信号。图3显示了C6荷瘤大鼠19F-BPA选择性空间生物分布图谱。将注射2.5 h后获得的19F图像(颜色等级:低=蓝色，高=红色)(图2)叠加在1H形态学参考上(in grey levels)。事实上，19F-BPA摄取的高度集中与C6胶质瘤细胞表现出19F-BPA载体的高度特异性的肿瘤部位是一致的。此外，肿瘤和周围组织中19F - bpa的非均匀摄取由图3所示的19F彩色图显示。实际上，每一种颜色(在图像处理中)都代表了超过阈值的19F磁共振最大信号的百分比(以上报告中为70%)。

   

为了监测C6胶质瘤中19F-BPA摄取情况，对同一只大鼠分别在注射后2.5(图2(a))、4(图2(b))和5 h时，进行连续4 h的19F MR轴向扫描采集
(图2(c))。测量每幅19F MR图像的信噪比(S/N)，得到如下值:5.1(图4(a))、3.7(图4(b))和2.5(图4(c))。这些结果表明，C6荷瘤大鼠的19F-BPA在输注2.5 h后达到最高浓度，而在此之后，F化合物的浓度随着时间的推移而降低，如图4(b)和(c)所示。

此外，没有评估19F-BPA-fr复合物的毒性注入剂量。事实上，所有的老鼠在输注后存活了2-3周，死亡只是因为肿瘤的后果。

3.2. Spectroscopic results
在图5中，我们报道了血液标本的特征高分辨率19F NMR光谱。19F-BPA-fr复合物注射结束后1、2.5和4 h从右股静脉采集的光谱分别如图5(a) - (c)所示。由于19F-BPA-fr复合物是racemic形式，所有光谱中的两个主要共振是合理的，因为两个非对映体复合物的形成。

图5所示的属于同一光谱的所有峰都大致等于FWHM。具体地说，在图5(a) - (c)中显示的峰值中，半最大值分别为61.04 Hz、73.24 Hz和24.41 Hz。此外，由此得到的T2∗值为:5.21 ms(图5(a))、4.35 ms(图5(b))和13.04 ms(图5(b))（译者注：实际上，主磁场B0无法达到绝对的均匀，因为氢原子旋转频率与B0的强度相关，不均匀的B0就会导致不同位置的氢原子旋转频率不一样，因此氢原子的旋转就会不同步，这样就加速了Mxy的衰减，这个衰减也是指数衰减，其时间常数为T2*。T2*比T2要小。）。

比较这些结果很有趣。的确，在注射后1小时和2.5小时采集的血液样本的T2∗值相似，二者的结果都略短于体外获得的溶解在血液溶液中的19F-BPA-fr复合物的横向松弛时间T2 (5.7 ms) (Porcari et al 2006)。

即使T2∗通常比T2短，这些结果表明，在注射1和2.5小时后，载硼体在体循环中可能与F-BPA复合物一致。相反，注射4小时后采集的血液标本的T2∗值(图5(c))明显高于之前提取的血液标本的T2∗值(注射后1和2.5小时)。这一观察结果可能与较小的分子运动速度较快相一致，这可能是由于该化合物在体内可能存在生物相互作用和代谢过程，导致19F-BPA-fr复杂简化的结果。

为了评价19F-BPA-fr复合物的药代动力学，采用峰积分法或光谱差法进行光谱定量。定量测量显示，在注射后1小时，血液中氟化化合物的总浓度(图5(a)所示的光谱)比在注射19F-BPA-fr复合物后2.5和4小时观察到的血液中(分别图5(b)和(c))大约高22%。事实上，在血液中测定的氟化合物的总浓度为2.5 h和4 h注射后相似。结果表明，在输注后1 ~ 2.5 h，氟化合物在体循环中的浓度下降了22%左右，并在输注后4 h保持稳定。比较血样的光谱结果和大鼠脑的成像结果是很有趣的。具体来说，图5(b)和图4(a)的光谱对比表明，注射2.5小时后肿瘤对19F-BPA的吸收最大，而在体循环中吸收最小。相反，将图5(c)所示的光谱与图4(b)所示的图像进行比较可以发现，在注射4小时后，肿瘤中氟化合物的浓度下降，而在血液中似乎保持不变。后一种现象可以解释为血液样本的重复提取导致了血液中19F浓度的降低。成像和光谱结果表明,含氟化合物的浓度在肿瘤增加直到2.5 h,输液,然后减少释放氟残留血液中根据先前的结果(Hsieh et al 2005)获得通过PET测量18FBPA。

4. Conclusion
本研究的体内实验表明，19F MRI联合1H MRI可以选择性地绘制19F -BPA的生物分布。我们使用C6大鼠胶质瘤模型进行测量，因为它的特征很好，在文献中常用来模拟人类胶质母细胞瘤。此外，使用19F成像监测肿瘤中19F BPA摄取的结果强烈表明，19F MRI是一种有用的方法，可以更好地了解和研究含氟药物的药代动力学。事实上，使用19F MRI和19F MRS得到的结果之间的相关性突出了对肿瘤和体循环中19F - bpa摄取的改进理解，从而显示了中子照射的最佳时机。这些在小啮齿动物身上获得的结果表明，19F成像和19F - bpa的光谱分析是可行和实用的方法，在BNCT临床试验中具有潜在的应用前景。此外，由于19F NMR可以通过适当调整RF线圈的1H MR扫描仪进行，未来的临床应用将只需要少量的MRI硬件和软件改进。