动物模型已经成为癌症，动脉粥样硬化，神经系统疾病（如阿尔茨海默氏病）和传染病研究中不可或缺的手段，而在这个过程中，很多情况下下需要使用到活体成像技术。原因是活体城乡技术可用于研究观测特异性细胞、基因和分子的表达或者相互作用关系，追踪靶细胞，药物，从分子和细胞水平对药物疗效进行成像，从病理水平评估疾病发展过程，对同一个动物进行时间，环境，发展和治疗效果进行跟踪，使后期的基因治疗用于病人效果最优。
活体成像技术的实验方法主要包括生物发光(bioluminescence)和荧光(Fluorescence)两种技术。生物发光技术是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白(如GFP,RFP等)对细胞或者DNA进行标记。活体成像技术主要有以下几个方面应用：
（1） 标记细胞，如癌症及药物研究、干细胞研究、细胞凋亡研究；
（2） 标记DNA及RNA，特别是基因治疗方面的应用
（3） 标记基因，如转基因动物模型研究，基因表达研究
（4） 标记细菌，如研究蛋白质相互作用、代谢等
首先介绍下活体成像仪器的组成及原理。生物光学成像仪器仅包含有限数量的基本组件：灵敏的CCD摄像头，用于荧光成像的滤光器系统和照明设备，与计算机控制的载物台组合的微距镜头，不透光的成像室 以及用于成像和控制的软件设备，详细见下图：
使用生物光学成像的最重要优势是成像过程的非破坏性和非侵入性。活体成像可以重复进行感染过程的监控，克服了动物与动物之间变异的问题。那在使用活体成像技术需要考虑如下三个方面：
1、 环境条件对生物发光和荧光产量的影响
2、 生物光学成像的空间分辨率和光敏性
3、 生物材料相关感染的定量和定位
着重说说第一个方面。生物发光(bioluminescence)和荧光(Fluorescence)两种技术都可以用来做活体成像研究。使用荧光成像技术如GFP荧光蛋白，其在体内对肿瘤的生长进行成像具有许多重要优势。与萤光素酶报道基因相比，GFP具有更强的信号，动物可以不受限制约束即可进行成像观察。使用荧光蛋白如GFP，只需用相当简单的设备进行观察及捕获成像照片，并且不需要完全黑暗的环境。GFP的荧光强度很强，并且GFP的蛋白质序列也已被“人源化”，使其能够在哺乳动物细胞中高度表达。与荧光素酶不同，荧光蛋白具有多种颜色，可以对多个事件进行成像。此外，GFP荧光相对不受外部环境的影响，因为发色团受蛋白质的三维结构保护。标记有GFP绿色荧光蛋白的细胞已用于追踪活啮齿动物的转移和血管生成。而且GFP绿色荧光蛋白表达细菌已用于研究小鼠中空间迁移和感染过程的行为。
图片来自Nat Protoc. 2006;1(3):1429-38
裸鼠GFP和RFP标记肿瘤的全身和开放式成像
说到这里，是不是觉得使用荧光蛋白进行活体成像更有优势呢？其实使用生物发光技术进行活体成像研究，是一种活体生物的光生化反应，是自然现象，和荧光蛋白相比，不需要光照激发就能观察到。生物发光技术如使用Firefly luciferase蛋白用作肿瘤细胞生长和转移的报告基因，目前还没有关于重复施用底物导致毒性的报道。生物发光技术特异性强，无自发荧光，灵敏度高，在体内可以检测到几百个细胞，检测深度在3-4cm，可以精确定量。
图片来自Cell Death Dis. 2017 Aug 31;8(8):e3022. doi: 10.1038/cddis.2017.396
DMSO和amlexanox治疗组的生物发光图像的定量分析
图片使用慢病毒载体为GV260(Ubi-firefly_Luciferase-IRES-Puromycin)
虽然荧光信号远远强于生物发光，但是非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。总结二者的优缺点见下表，对于不同的研究，可以根据二者的特点和具体的实验方案选择合适的方法。
附生物发光技术使用Luciferase进行活体成像简单实验步骤供参考：
（1） 根据实验需要，在动物成瘤或者静脉注射细胞/病毒后，对所需成像的动物在特定时间点进行活体成像（对体内荧光观察需要提前一天对实验动物禁食处理，以减少荧光干扰）；
（2） 按照10uL/g剂量腹腔注射底物D- Luciferin(15mg/mL)，等待15-20分钟左右；
（3） 根据动物体重按照10uL/g剂量腹腔注射0.7%戊巴比妥钠溶液；
（4） 5min左右后，动物彻底进入昏迷状态，食指轻轻按压动物胸口，测试心跳保证动物是成活状态。将昏迷动物放到活体成像仪器的暗室中，排好位置；
（5） 3，4步骤也可以使用活体成像仪器自带的气体麻醉系统进行异氟烷气体麻醉代替（不同仪器可能会有不同）；
（6） 使用成像仪器自带软件进行成像，使用软件进行定量分析和数据收集
（7） 将成像完成后的动物依次放回到饲养笼中，2小时后进行动物健康状态观察，或根据实验要求处死动物进行数据收集。
使用慢病毒GV260(Ubi-firefly_Luciferase-IRES-Puromycin)发表的文章举例：
1.Combinatorial CRISPR-Cas9 Metabolic Screens Reveal Critical Redox Control Points Dependent on the KEAP1-NRF2 Regulatory Axis. 2018. Molecular Cell, IF 17.819. A549 and HeLa Cas9--expressing stable cell lines.
2.Dissection and function of autoimmunityassociated TNFAIP3 (A20) gene enhancers in humanized mouse models. 2018. Nature Communications, IF 12.124. 293T Cas9-expressing stable cell line.
发光细胞——小鼠活体成像工具细胞
鼠活体成像是科学研究和药物研发的常用方法。进行此实验的前提是必须要有能稳定表达发光基因的细胞。常用的发光基因包括萤火虫萤光素酶（firefly luciferase，Fluc）、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（tdTomato）。本部分汇集了几种常用的稳定转染了Fluc的癌细胞系，并从Fluc、GFP、tdTomato转基因动物体内分离得到了发光的免疫细胞。这些细胞是进行基础研究和药物研发的常用工具。
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