【评测】TaqMan️探针和IDT PrimeTime️ 双淬灭探针的对比

本篇文章，我们将对应用较广的双淬灭探针（Double-Quenched Probe）做详细的介绍。

基于qPCR测试的结果，我们已将TaqMan®️探针替换成为IDT PrimeTime®️ 双淬灭探针。ZEN™️型双淬灭探针非常适合我们甲基化生物标志物的相关研究工作。靠近5'荧光基团的淬灭剂ZEN™️，不仅可以使qPCR探针在长达40碱基的情况下依旧保持较好淬灭效果，而且显著增加了探针的Tm值，非常适合癌症相关研究。

– 安朵涅特·佩里 博士 高级研究员 爱尔兰都柏林三一学院分子药物研究所

“双淬灭”探针顾名思义，就是有两道“消防线”来保证荧光基团的淬灭：在普通的5'核酸酶水解探针（图1. A）的基础上，除了探针3'端的普通淬灭基团（例如，Black Hole Quencher等），另在探针中间额外添加淬灭基团。

以IDT生产的经典双淬灭探针为例（图1. B）：在探针第9、10碱基之间添加专利的ZEN™️或TAO™️淬灭剂，与3'端IDT改进的专利淬灭基团—Iowa Black®️ Dark Quencher（IBRQ或IBFQ），构成两道“消防线”。

图1. 普通5'核酸酶水解探针和双淬灭探针的结构（D：Dye，荧光染料；Q：Quencher，淬灭基团；Z：ZEN™️）

除了对荧光的淬灭作用，ZEN™️还可以增强双链结构的稳定性，阻止核酸外切酶的酶切作用，且无细胞毒性。这些特性使其被IDT广泛应用于anti-miRNA序列（anti-miRNA oligonucleotides），splice-switching序列（splice-switching oligonucleotides）和miRNA、mRNA及InRNA的原位杂交探针。

IDT目前有ZEN™️型和TAO™️型两种双淬灭PrimeTime®️ qPCR探针（图2），分别搭配不同的荧光基团，两道“消防线”，灭“火”于无形之中。

图2. IDT双淬灭qPCR探针结构

技术优势

更低的背景

正如文章开篇佩里博士所陈述，双淬灭系统最重要的优势是能够降低荧光背景噪音，实现高信噪比，从而减少qPCR实验中由高背景导致的假阳性。

如图3所示，使用ZEN™型双淬灭探针（蓝色）qPCR的背景荧光值仅为单淬灭探针（绿色）的1/4。

图3. 与普通单淬灭5'核酸水解探针相比，ZEN™️型双淬灭探针淬灭效果更强，背景信号更低。

一般来讲，荧光染料和淬灭剂的距离变长会出现更多的荧光“泄漏”。这时候，两道“消防线”的双淬灭探针便脱颖而出。如图4所示，qPCR探针长度在20或40个碱基，双淬灭探针均可将背景荧光维持在较低的水平。

正如篇首所示，佩里博士在甲基化相关研究中，为了使探针的Tm值比引物高10°C 以上，设计了很多40碱基左右的双淬灭探针，测试后对其表现大为赞赏。

图4. 单/双淬灭探针对不同长度序列的淬灭效果

更为突出的是，双淬灭探针在定量甲基化特异扩增检测（Quantitative Methylation-specific PCR, qMSP）中优势尽显。未甲基化的CpG位点，经过亚硫酸钠处理后，会变成AT-rich区域，在较广长度范围内均可正常“施展”的双淬灭探针，可以较多的结合CpG位点，高效帮助研究人员探究甲基化的奥秘[1]。

更高的灵敏度

ZEN™️型双淬灭探针与单淬灭探针相比，qPCR实验Cq值降低，灵敏度升高。IDT在7900HT Real-Time PCR 系统标准循环条件下，对比5种qPCR探针在不同的cDNA起始量（0.005 ng - 5 ng）β-Actin的Cq值。结果显示，ZEN™️型双淬灭探针在不同的起始量下，平均Cq值均维持在最低的水平[2]。

图5. 与单淬灭探针相比，双淬灭探针在不同起始量下平均Cq值更低

2016年1月，瑞典乌普萨拉大学医学部临床病毒学的Hongyan Xia等人发表了利用巢式实时定量PCR检测诺如病毒（Norovirus）基因组II（Genogroup II，GII）的研究论文[3]。在针对诺如病毒的高度变异序列研究中，使用了长引物和长qPCR探针（多达56碱基）对GII进行检测。

研究人员测试了4种探针：LGC生产的内部不同位置加BHQ1的探针（如图6. A & B）和IDT生产的内部加ZEN™️的探针（单ZEN™️双淬灭探针和双ZEN™️三淬灭探针，如图6. C & D）。

图6. LGC和IDT生产的4种检测诺如病毒的qPCR探针结构

测试结果表明，LGC生产的NoProbe 1和NoProbe 2的检测下限分别为1000 copies / reaction和100 copies / reaction，而IDT的ZEN™️型探针NoProbe 3和NoProbe 4的检测下限低至10 copies / reaction，甚至6孔中的3个达到1 copy / reaction。

图7. 对诺如病毒GII通过qPCR制作标准曲线. (A) Noprobe 1. (B) Noprobe 2. (C) Noprobe 3. (D) Noprobe 4.

IDT 双淬灭探针具有高灵敏度，不仅适用于高拷贝数的临床样本，也可用于环境和食品检测或低拷贝数的病毒检测[3]。

2017年德克萨斯大学药学院Xiujuan Peng等人发表在Journal of Virological Methods的文章中，使用IDT双淬灭探针和SYBR Green的qPCR方法均可对M13和T7噬菌体进行检测。与酶联免疫吸附试验（ELISA）相比，qPCR方法可提高检测灵敏度和重复性。正是使用了ZEN™️型双淬灭探针，使得M13和T7噬菌体的检测范围低至27.5 copies/μL和 26.6 copies/μL[4]。

降低多重qPCR通道间串扰

双淬灭探针有效降低背景信号的特性，还可以帮助实现多重qPCR（Multiplex qPCR），有效减少不同通道之间的串扰[4]。下面我们将通过一个IDT双淬灭探针应用于多重检测的实例来了解两道“消防线”带来的“品质保证”。

来自美国Tetracore公司的研发人员一直致力于研发基于qPCR的传染病等诊断试剂，其检测产品因适配多种PCR平台，且在各种环境条件下表现稳定，为军队、动物检疫等机构提供了解决方案。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRSSV）可引起猪群多系统病症。PRSSV主要包含美洲型（American-like）和欧洲型（European-like）两种大类，对PRSSV进行分类需要检测多个位点。Tetracore公司开发的检测方案，包含34条引物和8条qPCR探针，可以同时进行多重qPCR检测。其中8条qPCR探针利用了3种荧光基团，可以在3通道的qPCR平台进行检测，1个通道检测对照组，其余7条探针分别用其他两个通道进行检测（表1）。

表1. PRSSV检测探针荧光基团与对应通道

多重通道检测荧光信号的串扰是个令人烦恼的问题。为了使PRSSV多重检测分辨率提高，研发人员引入了ZEN™️型双淬灭探针，即5'FAM/ZEN/3'IBFQ探针，与普通的单淬灭探针相比，可有效降低假阳性，减少背景荧光。如图8所示，利用18碱基的5'FAM修饰的qPCR探针对长度为120 bp PRRSV区域进行检测，其中B11和B12（红色）代表5'FAM/3'BHQ单淬灭探针，A7和A9（蓝色）代表5'FAM/ZEN/3'IBFQ双淬灭探针[5]。ZEN™️使FAM荧光在测试的过程中不再干扰相邻的Cy3通道。

图8. ZEN™️型双淬灭探针解决了多重qPCR中的荧光“泄露”问题

性价比高

目前IDT提供ZEN™️型和TAO™️型两种双淬灭PrimeTime®️ qPCR探针，其搭配的荧光基团如表2。

表2. IDT提供双淬灭探针详情

有任何技术问题，欢迎搜索“北京泽平科技”进行技术支持咨询报价。

参考文献

[1]https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/epigenetic-biomarkers-for-prostate-cancer

[2]http://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/zen

[3]Xia, H., S. Gravelsina, C. Ohrmalm, J. Ottoson and J. Blomberg (2016). "Development of single-tube nested real-time PCR assays with long internally quenched probes for detection of norovirus genogroup II." Biotechniques 60(1): 28-34.

[4]Peng, X., A. Nguyen and D. Ghosh (2018). "Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR." J Virol Methods 252: 100-107.

[5]https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/optimizing-multiplex-qpcr-for-detecting-infectious-diseases-and-biothreat-agents-in-the-field